熊 瑛葉偉萍古 航

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（上海 200092）；2.上海長(zhǎng)海醫(yī)院（上海 200433）

ADAM3A基因拷貝數(shù)差異與先天性膈疝相關(guān)性分析

熊 瑛1葉偉萍1古 航2

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（上海 200092）；2.上海長(zhǎng)海醫(yī)院（上海 200433）

目的通過(guò)對(duì)先天性膈疝胎兒多基因位點(diǎn)的檢測(cè)，評(píng)價(jià)基因拷貝數(shù)變化與胎兒先天性膈疝之間的關(guān)系。方法采用Affymetrix Cytoscan 750 k平臺(tái)微陣列分析11例先天性膈疝新生兒的多基因位點(diǎn)（其中1例為雙胎，其異卵雙胞胎兄弟被診斷為胎兒腸擴(kuò)張）。結(jié)果在1例先天性膈疝新生兒中發(fā)現(xiàn)一個(gè)純合子缺失，8 p11.22 arr[hg19]，并最終證實(shí)為解聚素和金屬蛋白酶（ADAM）3A基因的1～15外顯子發(fā)生純合缺失。結(jié)論ADAM3A拷貝數(shù)的改變可能是先天性膈疝的發(fā)病原因。

微陣列芯片； 先天性膈疝； ADAM3A基因； 拷貝數(shù)改變

先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia，CDH）是一種危及生命的先天性缺陷，其新生兒發(fā)病率和死亡率都較高[1]。在美國(guó)一個(gè)隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)CDH在1995年至2002年的發(fā)病率是0.193%[2]。CDH可分為三種主要類(lèi)型：胸腹裂孔疝、胸骨后疝和食管裂孔疝[3]，其中胸腹裂孔疝最為多見(jiàn)，而食管裂孔疝最為罕見(jiàn)。CDH通常在妊娠期間被診斷，有時(shí)可能作為一個(gè)孤立的缺陷存在或同時(shí)還伴有其他異常。CDH的病因至今仍然不明。近期其遺傳病因正逐漸被確定[4]。本研究旨在確定CDH的發(fā)生與拷貝數(shù)變異（CNV）之間的關(guān)系。

1 臨床資料

選擇2014年2月至2015年5月在上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院產(chǎn)前已經(jīng)超聲及胎兒磁共振成像（MRI）確診為CHD并分娩的11例新生兒作為研究對(duì)象。其中，男7例、女4例，平均出生體質(zhì)量（2 967.5±306.2）g，順產(chǎn)4例、剖宮產(chǎn)7例，Apgar評(píng)分、手術(shù)方式以及預(yù)后等見(jiàn)表1。11例新生兒中1例為雙胎妊娠，其異卵雙胎兄弟被診斷為腸擴(kuò)張。

CDH新生兒出生前抽取孕母外周血約5 mL，于分娩即刻抽取臍血約5 mL，分別置于抗凝管中混勻后離心分離血漿及細(xì)胞－80 ℃冰箱凍存以備DNA抽提。臍血及孕母外周血基因組DNA的提取使用Blood DNA kit（Tiangen生物技術(shù)，北京）。使用Thermo NANODROP 2000來(lái)測(cè)算提取DNA的濃度和純度。所有標(biāo)本的CNV的微陣列分析均使用Affymetrix Cytoscan 750K Array平臺(tái)。Affymetrix Cytoscan 750K Array平臺(tái)包含超過(guò)550 000個(gè)標(biāo)記拷貝數(shù)和200 000個(gè)基因型的單核苷酸多態(tài)性（SNP）[5]。分析基因型和拷貝數(shù)采用。

僅1例CHD新生兒發(fā)現(xiàn)純合缺失，染色體8 p11.22 arr[hg19]8p11.22(39226335-39388919)，此種缺失可能為潛在的致病原因。這個(gè)純合缺失包括兩個(gè)基因ADAM5和ADAM3A。為了確定純合子缺失總值，選擇該患兒的ADAM3A外顯子（NR_001569.3 NC_000008.11）和 ADAM LOC100130964（NR_046245.1 NC_000008.11）來(lái)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表2。同時(shí)對(duì)患兒臍血及母血所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增電泳分析表明純合子缺失總值至少包括ADAM3A的外顯子1～15（圖1）。ADAM3A上游斷點(diǎn)位于外顯子15～16，下游斷點(diǎn)位于5’ADAM3A的上游。

表1 胎兒人口數(shù)據(jù)

圖1 PCR擴(kuò)增確認(rèn)ADAM3A純合子缺失總值

表2 引物序列

2 討論

本研究采用了全基因組芯片（即Affymetrix CytoScan 750k），芯片探針涵蓋了復(fù)發(fā)性基因組病及常見(jiàn)微缺失/微重復(fù)綜合征區(qū)域，同時(shí)覆蓋亞端粒區(qū)域；探針覆蓋的區(qū)域可檢測(cè)出小至幾十kb的變異；能檢測(cè)出目前已知印記區(qū)域的純合區(qū)。目前全基因芯片在遺傳疾病檢測(cè)中已被廣泛應(yīng)用[6]，例如：①不明原因的智力落后或發(fā)育遲緩；②非已知綜合征伴發(fā)的多發(fā)畸形；③孤獨(dú)癥譜系障礙及其他精神神經(jīng)發(fā)育障礙。同時(shí)在產(chǎn)前診斷中全基因組芯片也有較多的應(yīng)用：①超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常，如核型分析正常，則建議進(jìn)一步行染色體基因芯片分析（chromosomal micro array analysis，CMA）檢查；②對(duì)于死胎或死產(chǎn)、需行遺傳學(xué)分析者，建議對(duì)胎兒組織行CMA檢測(cè)，可提高其病因的檢出率；③對(duì)于胎兒核型分析結(jié)果不能確定染色體是否存在畸變，建議采用CMA技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分析以明確診斷。

CDH是新生兒嚴(yán)重畸形之一，與CDH相關(guān)的新生兒及胎兒死亡發(fā)生率在50%～80%[7]。CDH常合并呼吸、心血管等多臟器發(fā)育畸形，引起一系列病理生理變化，是新生兒危急重癥之一，尤其是重癥 CDH，死亡發(fā)生率高。目前CDH的發(fā)病原因還不是很明確，最近的遺傳病因正逐漸在CDH相關(guān)研究中被確定[4]。有眾多文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)一些基因的異常改變可能導(dǎo)致CHD，例如GATA6、HNF3α、HNF-3β、TTF-1、Nmyc、Shh、Bmps、Hox基因等[8]。相關(guān)研究證實(shí)，ZFPM2缺失可引起不完全外顯性遺傳的孤立膈肌缺損[9]。而蛋白質(zhì)分子的變化，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變（酪氨酸激酶受體途徑的改變）等多種因素都有可能引起胚胎肺發(fā)育異常進(jìn)而導(dǎo)致先天性膈疝形成[9]。至今國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)的遺傳基因報(bào)道文獻(xiàn)。

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外的研究仍無(wú)法明確CHD的發(fā)病機(jī)制及原理，而CHD的診治及預(yù)測(cè)對(duì)于產(chǎn)科及兒科醫(yī)師仍是一個(gè)巨大的難題。目前國(guó)內(nèi)外的研究提示基因的異常改變可能是CHD的發(fā)病機(jī)制，因此本研究從基因出發(fā)，對(duì)CHD患兒的基因進(jìn)行篩查，以期發(fā)現(xiàn)可能的致病基因。本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)純合子缺失8p11.22arr[hg19]8 p11.22(39226335-39388919)，可能是發(fā)生CDH的一個(gè)遺傳原因。ADAM3A的這個(gè)純合缺失包括外顯子1～15。ADAM3A也被稱(chēng)為ADAM3、CYRN1和tMDCI。這種基因被證明是假基因，對(duì)于人類(lèi)來(lái)說(shuō)是沒(méi)有功能的[10]。ADAM家族基因可能與細(xì)胞連接和附著力有關(guān)。ADAM3A純合子的缺失被認(rèn)為在兒童高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤（pHGG）中扮演重要角色[11]。ADAM3A的過(guò)度表達(dá)可能與結(jié)膜鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）有密切關(guān)系[12]。從本研究結(jié)果中可以看到，ADAM3A基因與CHD存在著密切的聯(lián)系。由于CDH是罕見(jiàn)病，病例數(shù)仍很有限。在有限的病例標(biāo)本中，行CNV檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1例患兒有大片段基因的缺失變異，并經(jīng)過(guò)PCR等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，推斷ADAM3A純合子缺失可能是CDH的一個(gè)遺傳學(xué)病因。本研究中有1例為雙卵雙胎，兩個(gè)胎兒及孕母均進(jìn)行了基因檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)有異常的基因變異。對(duì)于CHD患兒存在ADAM3A基因純合子缺失而言，將來(lái)仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，擬通過(guò)檢測(cè)該基因的拷貝數(shù)改變來(lái)預(yù)測(cè)CDH的發(fā)生可能性。

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（收件日期：2016-11-11）

（本文編輯：鄒 強(qiáng)）

Analysis of the correlation between copy number difference of ADAM3A gene and congenital diaphragmatic hernia

XIONG Ying1, YE Weiping1, GU Hang2(1.Department of Obstetrics，Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China；2. Department of Obstetrics, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China)

ObjectiveTo evaluate the relationship between the number of copies of genes and congenital diaphragmatic hernia by the detection of multiple loci in infants with congenital diaphragmatic hernia.MethodsMultiple loci were analyzed by Microarray analysis of Affymetrix Cytoscan 750 k in 11 neonates with congenital diaphragmatic hernia, in whom 1 case was twins,and his fraternal twins were diagnosed of fetuse intestinal dilatation.ResultsA homozygous deletion (8 p11.22 arr[hg19])was found in one neonate with congenital diaphragmatic hernia, and was eventually confirmed that the depolymerization of the biotin and metalloprotease (ADAM) 3A genes lead to homozygous deletion of the 1～15 exon. Conclusion The alteration of ADAM3A copy number may be the cause of congenital diaphragmatic hernia.

microarray chip; congenital diaphragmatic hernia; ADAM3A gene; copy number change

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.09.005

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院集團(tuán)基金（No.12XJ2003）

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