□ 于喆源 甘肅省張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 張 婕 甘肅省蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所

對(duì)食品中脫氫乙酸HPLC檢驗(yàn)方法的改進(jìn)

□ 于喆源 甘肅省張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 張 婕 甘肅省蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所

在脫氫乙酸的高效液相法檢測(cè)時(shí)，常會(huì)因?yàn)楸Ａ魰r(shí)間漂移和峰形拖尾嚴(yán)重，影響對(duì)目標(biāo)物的定性和定量。本文試 圖通過(guò)對(duì)脫氫乙酸化學(xué)性質(zhì)的分析及考察樣品pH、流動(dòng)相pH、色譜柱類型對(duì)檢測(cè)的影響，有效控制拖尾和保留時(shí)間漂移，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。研究結(jié)果表明：脫氫乙酸在中性或堿性環(huán)境下，烯醇互變后的-O-結(jié)構(gòu)次級(jí)保留是造成峰形不對(duì)稱和保留時(shí)間漂移的主要原因。通過(guò)采用封尾工藝的色譜柱，pH=4．5的醋酸鈉緩沖液-甲醇（85︰15）體系流動(dòng)相可以得到較為理想的保留時(shí)間，峰形及響應(yīng)，樣品pH在5～7有較好的穩(wěn)定性。該方法的回收率、精密度、檢出限、重現(xiàn)性良好，能更好地滿足樣品檢驗(yàn)的需求。

高效液相色譜；pH值；脫氫乙酸

脫氫乙酸鈉是一種廣譜類、抑菌力極強(qiáng)的食品防腐劑，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。對(duì)霉菌、酵母菌、細(xì)菌的抑制能力特別強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于果汁、腐乳、醬菜、人造奶油、乳酸菌飲料、果醬和糕點(diǎn)等各類食品加工行業(yè)中[1-2]。在我國(guó)為合法添加劑，最大限制為0.3 g/kg。

圖1 脫氫乙酸（鈉）分子結(jié)構(gòu)式圖

目前，脫氫乙酸的檢測(cè)國(guó)標(biāo)方法為氣相色譜法和高效液相色譜法[3]。氣相色譜法的前處理復(fù)雜，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程較為繁瑣，目前大部分實(shí)驗(yàn)室依然選擇使用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)分析[4-5]。在實(shí)驗(yàn)中，依據(jù)國(guó)標(biāo)方法，采用C18色譜柱，乙酸銨緩沖鹽溶液-甲醇（90︰10）體系為流動(dòng)相時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)保留時(shí)間漂移和嚴(yán)重的峰形拖尾現(xiàn)象，通常的解決思路是進(jìn)一步凈化減少基質(zhì)影響或調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，使其滿足分析要求。但凈化方法的選擇及頻繁調(diào)整流動(dòng)相比例會(huì)造成實(shí)驗(yàn)復(fù)雜程度的增加，增加實(shí)驗(yàn)的不確定性。因此，本文通過(guò)分析脫氫乙酸化學(xué)性質(zhì)，研究色譜柱工藝和樣品pH、流動(dòng)相pH對(duì)分析的影響，并提出改進(jìn)方法，盡可能達(dá)到在穩(wěn)定色譜條件分析目標(biāo)物的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫1260型，配有二極管陣列檢測(cè)器；萬(wàn)分之一天平：EL204-IC，瑞士梅特勒；千分之一天平：ML503/02，瑞士梅特勒；離心機(jī)：10 000 r/min，tgl-16a高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；酸度計(jì)：梅特勒320型，瑞士梅特勒；甲醇：色譜純，德國(guó)默克進(jìn)口；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.5%，美國(guó)sigma公司；其他試劑均為優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水為滿足GB/T 6682的一級(jí)水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

脫氫乙酸儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：精密稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用20 mL氫氧化鈉溶液（20 g/L）溶解后用水定容。4 ℃保存，3個(gè)月有效。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10 mL和20 mL的脫氫乙酸儲(chǔ)備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100 μg/mL和200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個(gè)月有效。

1.3 樣品處理

稱取樣品1 g（液體樣品吸取1 g）至50 mL離心管中，精密加水15 mL，超聲處理30 min，然后分別精密加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2.5 mL，振搖，8 000 r/min離心10 min，取上清液，分別用乙酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為5、7、9，過(guò)0.45 μm濾膜后上機(jī)。

1.4 色譜條件

第一組：C18未封尾+乙酸銨（0.02 mol/L）緩沖液-甲醇（90︰10）體系流動(dòng)相。

第二組：C18封尾柱+乙酸銨（0.02 mol/L）緩沖液-甲醇（90︰10）體系流動(dòng)相。

第三組：C18封尾柱+乙酸銨（0.02 mol/L，后用乙酸調(diào)節(jié)pH為5.5）緩沖液-甲醇（90︰10）體系流動(dòng)相。

第四組：C18封尾柱+乙酸鈉（pH=4.5）緩沖液-甲醇（90︰10）體系流動(dòng)相。

封尾柱為：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）

非封尾柱為：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

檢測(cè)器波長(zhǎng)：293 nm；進(jìn)樣量：10 μL，流速1 mL/min，保留時(shí)間定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品pH對(duì)檢驗(yàn)的影響

依據(jù)上述樣品處理方法，調(diào)節(jié)pH后，國(guó)標(biāo)色譜條件（第一組）進(jìn)樣，考察其保留時(shí)間，峰形對(duì)稱性。如圖2所示。

由圖2可以得出，樣品pH的變化對(duì)脫氫乙酸的保留行為在酸性、中性情況下的影響不顯著，但在堿性環(huán)境下，脫氫乙酸會(huì)得到裂峰。故拖尾因子未標(biāo)出，且不能作為定量定性依據(jù)。分析原因?yàn)樵诹鲃?dòng)相中，部分離子態(tài)脫氫乙酸（鈉）變?yōu)榉肿討B(tài)，保留行為發(fā)生改變，使其洗脫不能同步進(jìn)行，故出現(xiàn)裂峰。國(guó)標(biāo)GB 5009.121-2016要求對(duì)樣品提取液要調(diào)節(jié)pH值至中性或酸性，分析原因是多數(shù)糕點(diǎn)會(huì)使用純堿等堿性物質(zhì)，所以堿性較強(qiáng)，不利于分析。因此，確定樣品pH為7為最佳。

2.2 色譜柱工藝對(duì)檢驗(yàn)的影響

國(guó)標(biāo)規(guī)定為C18反相色譜柱，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，因色譜柱選擇不同，其峰形存在很大差異。在未使用封尾工藝的色譜柱上，國(guó)標(biāo)色譜條件會(huì)使峰明顯拖尾，如圖3所示；且保留時(shí)間漂移明顯；在使用封尾柱后，拖尾情況改善明顯，如圖4所示；且保留時(shí)間穩(wěn)定。具體保留時(shí)間對(duì)比見(jiàn)表1。

脫氫乙酸屬于非羧基酸類，在中性或堿性環(huán)境下，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)中存在C=O雙鍵的共軛穩(wěn)定作用，所以使其中一個(gè)C=O烯醇互變?yōu)镃-O-的結(jié)構(gòu)，和色譜柱填料表面未鍵合的硅羥基殘基產(chǎn)生強(qiáng)的次級(jí)保留，使得峰形變形嚴(yán)重，保留時(shí)間漂移。采用封尾柱后，未鍵合硅羥基大部分被屏蔽，峰形對(duì)稱性好轉(zhuǎn)，保留時(shí)間穩(wěn)定。綜上，采用封尾工藝的色譜柱更加有利于在脫氫乙酸的分析中得到穩(wěn)定的色譜響應(yīng)。

2.3 流動(dòng)相pH對(duì)檢測(cè)的影響

表2是樣品pH為7，采用封尾工藝色譜柱時(shí)，不同pH流動(dòng)相對(duì)其峰形和保留時(shí)間的影響。由表2可知，流動(dòng)相pH對(duì)于脫氫乙酸的保留時(shí)間無(wú)明顯影響，但對(duì)其峰形對(duì)稱性有較為明顯的影響。在使用中性體系流動(dòng)相時(shí)，峰形對(duì)稱性差，隨著流動(dòng)相酸性的增加，峰形對(duì)稱性好轉(zhuǎn)，當(dāng)pH達(dá)到4.5時(shí)，峰形對(duì)稱性已到達(dá)1.01。分析原因，在酸性環(huán)境下，脫氫乙酸烯醇互變產(chǎn)生的具有明顯堿性的-O-幾乎不存在，脫氫乙酸以分子形態(tài)存在，色譜柱保留行為穩(wěn)定，且因-O-不存在，使得次級(jí)保留基本消失，故能得到良好峰形。綜上，乙酸鈉（pH=4.5）緩沖液-甲醇體系流動(dòng)相更適合脫氫乙酸分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性，精密度和最低檢出限

使用1.2配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，在上述實(shí)驗(yàn)中得到的最佳條件進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)（x軸），峰面積為縱坐標(biāo)（y軸）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=22.4379 9x-17.156 86，r=0.999 8，線性良好。6針連續(xù)進(jìn)樣，RSD小于0.7%，精密度良好。在該條件下，以3倍信噪比為檢出限，以10倍信噪比為定量限，檢測(cè)線達(dá)到國(guó)標(biāo)GB 5009.121-2016對(duì)檢出限、定量限的規(guī)定。

圖2 不同pH值對(duì)RT、拖尾因子的影響

圖3 采用未封尾色譜柱色譜圖

圖4 采用封尾工藝色譜柱色譜圖

表1 柱工藝對(duì)保留時(shí)間的影響表

表2 流動(dòng)相pH值對(duì)保留時(shí)間及拖尾因子的影響表

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)脫氫乙酸化學(xué)性質(zhì)的分析和實(shí)驗(yàn)證明，在脫氫乙酸的分析中，采用封尾色譜柱和偏酸性流動(dòng)相可以得到穩(wěn)定的結(jié)果。而且在實(shí)驗(yàn)中也證明，當(dāng)流動(dòng)相構(gòu)成為酸鈉（pH=4.5）緩沖液-甲醇體系時(shí)，通過(guò)調(diào)整兩相比例，對(duì)峰形和穩(wěn)定性影響不顯著。故從實(shí)驗(yàn)效率的角度考慮，選擇85︰15的比例作為實(shí)驗(yàn)比例，可以在保證穩(wěn)定的情況下，有效提高實(shí)驗(yàn)效率，減少工作負(fù)荷。

[1]駱萌．脫氫乙酸及相關(guān)化合物生產(chǎn)技術(shù)[J]．化工中間體，2004(1)：31-33．

[2]明立艷，張忠義．高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量[J]．食品研究與開(kāi)發(fā)，2009(3)：106-108．

[3]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．GB/T 23377-2009 食品中脫氫乙酸的測(cè)定 高效液相色譜法[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009．

[4]王若燕，王立 ．高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量的研究[J]．浙江科學(xué)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003(11)：97-99．

[5]曾麗娟．高效液相色譜法測(cè)定月餅中防腐劑的方法研究[J]．計(jì)量與測(cè)試技術(shù)，2005(9)：42-43．

于喆源（1991—），男，甘肅張掖人，本科，工程師。研究方向：食品與藥品檢驗(yàn)檢測(cè)。