葛潤洲，羅 薇，楊懷珍，孔雪英

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041)

大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌的耐藥性分析

葛潤洲，羅 薇*，楊懷珍，孔雪英

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041)

研究大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌的耐藥性及其耐藥基因的攜帶情況。采用K-B紙片法對33株大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌進行20種抗菌藥物敏感性測定，應用PCR對12種耐藥基因的攜帶情況進行檢測。結果表明，33株沙門菌分離株對阿莫西林、萘啶酸耐藥性最高，分別為93.94%、87.88%，對氨芐西林(54.55%)、四環(huán)素(48.49%)、多西環(huán)素(48.49%)、卡那霉素(60.61%)、慶大霉素(48.49%)、鏈霉素(66.67%)耐藥性比較嚴重，對氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星敏感。共檢測到9種耐藥基因，其中blaCMY-2陽性率為87.88%，qnr、aac(6′)-Ib-cr陽性率分別為17.24%、 86.21%，tetA、tetB陽性率分別為45%、20%，aph(3)Ⅱ、aac(3)Ⅱ、aadA1陽性率分別為100%、10%、20%， sul2陽性率為100%，未檢出blaTEM-1、tetC、tetG基因。說明大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌嚴重耐藥，且攜帶多種耐藥基因。

沙門菌；耐藥性；耐藥基因

沙門菌(Salmonella)是一種常見的病原菌，被認為是全球第1種最常見的引起人類疾病的食源性細菌，不僅可直接感染人類，還可以通過動物性食品，如雞肉、牛肉、豬肉、雞蛋、牛奶、海鮮等食源性感染人類，從而引起疾病[1-2]。沙門菌病是最常見的細菌性食源性疾病之一， 是影響全球食品安全和公共衛(wèi)生問題[3]。據估計,2000年沙門菌造成約2 160萬人患病，導致約20萬人死亡[4]；在美國，每年大約有120萬人因沙門菌感染患病，約400人死亡，造成大約365億美元的經濟損失[5-6]；中國約有22.2%食源性疾病是由沙門菌引起的[7]。在人類臨床治療、畜牧業(yè)生產中， 抗菌藥物仍然是治療各種病原菌的首選藥物，但在過去的幾十年中，由于抗菌藥物的廣泛使用及濫用，導致沙門菌耐藥率逐年上升， 耐藥譜型迅速增寬， 給食品安全和公共衛(wèi)生安全造成了極大危害[8-10]。本研究對成都邛崍、雙流等地大雁、天鵝人工馴養(yǎng)基地分離的33株大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌進行了藥物敏感性試驗，并對相關耐藥基因進行檢測，了解大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌耐藥情況，為臨床治療沙門菌病的合理用藥及沙門菌多重耐藥機制的進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 質控菌株大腸埃希菌ATCC25922，西南民族大學動物醫(yī)學實驗室提供；試驗用33株沙門菌由采自成都邛崍、雙流等地大雁、天鵝人工馴養(yǎng)基地的病料，經西南民族大學動物醫(yī)學實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 MH瓊脂、MH肉湯，北京陸橋技術有限責任公司產品；2×TaqPCR Master-Mix、Plus DNA Marker DL 1 200，上海生工生物工程技術服務有限公司產品。

1.1.3 藥敏紙片 20種抗菌藥物包括氨芐西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢噻肟(cefotaxime )、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢拉定(cephradine)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、恩諾沙星(enrofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、四環(huán)素(tetracycline)、多西環(huán)素(doxycycline)、丁胺卡那(amikacin)、慶大霉素 (gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、鏈霉素 (streptomycin)、甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、氟苯尼考(florfenicol)，杭州微生物股份有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 根據世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的K-B紙片擴散法進行藥敏試驗。以大腸埃希菌ATCC25922質控菌株，測定分離株的藥物敏感性。

1.2.2 細菌DNA的提取 參照文獻[11]的方法，采用微波加熱法提取細菌DNA。具體方法如下：取1.5 mL菌液12 000 r/min離心2 min，收集菌體，加入滅菌生理鹽水洗滌菌體3次后，再加入TE緩沖液洗滌菌體2次，離心棄上清，加入500 μL TE緩沖溶液重懸菌體，取100 μL懸液于PCR管中，微波分別加熱40、 50、60、70 s，離心取上清， 置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 耐藥基因PCR引物設計、擴增及耐藥基因的序列分析 參照GenBank中登錄的耐藥基因序列及相關文獻[12-14]設計了11對引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。分別用于擴增β-內酰胺類耐藥基因blaCMY-2、blaTEM-1，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetG，磺胺類耐藥基因sul2，氨基糖苷類耐藥基因aph(3)Ⅱ、aac(3)Ⅱ、aadA1，氟喹諾酮類耐藥基因qnr。

PCR反應體系：2×TaqPCR Master-Mix 10 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水加至20 μL。PCR反應參數:95 ℃ 10 min；95 ℃ 1 min，55 ℃～60 ℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產物使用15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，電泳后回收PCR產物，測序后在GenBank數據庫進行序列分析。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果

33株沙門菌分離株對20種抗菌藥物的敏感性測定結果見表2。 33株沙門菌對阿莫西林、萘啶酸耐藥性最高，分別為93.94%、87.88%，對氨芐西林的耐藥率為54.55%、四環(huán)素為48.49%、多西環(huán)素為48.49%、卡那霉素為60.61%、慶大霉素為48.49%、鏈霉素為66.67%，耐藥性比較嚴重，僅對氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星敏感。三重以上耐藥的菌株高達93.94%，七重以上耐藥的菌株為27.27%，耐藥最多的菌株可耐受16種抗菌藥物。

2.2 抗菌藥物耐藥基因檢測結果與序列分析

33株沙門菌耐藥基因檢測結果見表3，部分耐藥基因檢測結果圖見圖1～圖9。其中，β-內酰胺類耐藥菌株有29株檢出了blaCMY-2基因，檢出率達87.88%，未檢出檢出blaTEM-1；20株四環(huán)素類耐藥菌株中9株檢出tetA基因、4株檢出tetB基因，檢出率分別為45%和20%，未檢出tetC、tetG基因；6株磺胺類耐藥菌株中均檢測到sul2基因；30株氨基糖胺類耐藥菌株中aph(3)Ⅱ 基因均有檢出， 3株檢出aac(3)Ⅱ基因、6株檢出aadA1基因，檢出率分別為10%、20%，29株喹諾酮類耐藥菌株中僅5株檢出qnr基因，檢出率為17.24%,25株檢測出aac(6′)-Ib-cr基因，檢出率為86.21%。測序結果顯示各耐藥基因序列與預期序列高度相似。

表1 耐藥基因引物序列

3 討論

抗菌藥物用于治療細菌感染為人類及動物帶來了諸多好處，但大量的抗菌藥物被同時用于生長促進劑，以及不適當地濫用于動物養(yǎng)殖中細菌感染的預防和治療，使得抗菌藥物的耐藥性日益增加，甚至產生了多重耐藥[15-19]。不斷增加的抗菌藥物耐藥性已成為全球范圍內的一個重要問題。Rahmani M等[20]對伊朗2007年—2011年分離的沙門菌進行藥敏試驗，結果顯示沙門菌分離株都對兩種抗菌藥物耐藥，且對萘啶酸和環(huán)丙沙星的耐藥率達94%；Li B等[21]對美國東南部水中分離的沙門菌進行藥敏試驗，結果所有菌株對慶大霉素、環(huán)丙沙星、萘啶酸、甲氧芐氨嘧啶耐藥；Ke B等[22]對中國廣東2007年—2012年分離的沙門菌研究結果表明，沙門菌對復方新諾明、四環(huán)素、萘啶酸、氨芐青霉素和鏈霉素都有抗性。

表2 33株沙門菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖1部分菌株blaCMY-2基因PCR擴增結果

Fig.1 PCR amplification results of blaCMY-2 gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖2部分菌株qnr基因PCR擴增結果

Fig.2 PCR amplification result of qnr gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖3部分菌株aac(6′)-Ib-cr基因PCR擴增結果

Fig.3 PCR amplification result of aac(6′)-Ib-cr gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～5.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-5.PCR products of isolates

圖4部分菌株tetA基因PCR擴增結果

Fig.4 PCR amplification result of tetA gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖5部分菌株tetB基因PCR擴增結果

Fig.5 PCR amplification result of tetB gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖6部分菌株aph(3)Ⅱ基因PCR擴增結果

Fig.6 PCR amplification result of aph(3)Ⅱ gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖7部分菌株aac(3)Ⅱ基因PCR擴增結果

Fig.7 PCR amplification result of aac(3)Ⅱ gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖8部分菌株aadA1基因PCR擴增結果

Fig.8 PCR amplification result of aadA1 gene

M.DNA 標準DL 1 200;N.陰性對照;1～9.分離株PCR產物

M.DNA Marker DL 1 200;N.Negative control;1-9.PCR products of isolates

圖9部分菌株sul2基因PCR擴增結果

Fig.9 PCR amplification result of sul2 gene

表3 含耐藥基因的菌株數與耐藥菌株數的比較

本研究對33株大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌進行藥敏試驗，結果顯示，沙門菌耐藥嚴重。其中對阿莫西林和萘啶酸的耐藥性最高，與陸彥等[23]、賴海梅等[24]研究結果基本一致；對氨芐西林、四環(huán)素、多西環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的耐藥率為在45%～70%，臨床上都應該謹慎使用。耐藥率在20%及以下的頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那、甲氧芐氨嘧啶、氟苯尼考以及氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星無耐藥株產生的這些藥物在臨床上可以繼續(xù)使用。所有菌株均呈現多重耐藥，三重以上耐藥的菌株高達93.94%，七重以上耐藥的菌株為27.27%，耐藥最多的菌株可耐受16種抗菌藥物。

本研究對抗菌藥物表型耐藥的沙門菌攜帶相應耐藥基因,如β-內酰胺類耐藥基因blaCMY-2、blaTEM-1，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetG，磺胺類耐藥基因sul2，氨基糖苷類耐藥基因aph(3)Ⅱ、aac(3)Ⅱ、aadA1，氟喹諾酮類耐藥基因qnr進行了檢測，共檢測到9種耐藥基因。結果表明大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌攜帶多種耐藥基因，且總體上耐藥基因與耐藥表型的檢測結果基本一致， blaCMY-2、aac(6′)-Ib-cr、aph(3)Ⅱ、sul2檢出率均很高，與藥敏試驗的結果的結果基本一致；但藥敏試驗中耐四環(huán)素的菌株其四環(huán)素類耐藥基因檢出率較低，這可能與基因的表達程度、不同藥物的抗菌活性、對酶的穩(wěn)定性差異以及基因型的流行有關，還有待進一步研究。

抗菌藥物耐藥性威脅全球安全，需要迫切解決，本研究對大雁、斑頭雁和天鵝源沙門菌的藥敏性特征及相關耐藥基因的研究，可以更好地了解沙門菌的耐藥機理，對有效控制日趨嚴重的沙門菌耐藥性問題提供了依據。

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AnalysisofAntimicrobialResistanceamongSalmonellaIsolatedfromGeese,Bar-headedGeeseandSwans

GE Run-zhou,LUO Wei，YANG Huai-zhen，KONG Xue-ying

(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China)

The objective of this study was to investigate the antimicrobial resistance and the resistance genes in 33 pathogenicSalmonellastrains isolated from geese,bar-headed geese and swans with the Kirby-Bauer method to detect antimicrobial resistance and PCR detection for 12 antimicrobial resistant genes.The results indicated that the resistant rate to amoxicillin was 93.94%,nalidixic acid 87.88%,followed by streptomycin 66.67%，kanamycin 60.61%,ampicillin 54.55%,tetracycline 48.49%,doxycycline 48.49%,gentamicin 48.49%,and with no resistance to ofloxacin,pefloxacinand norfloxacin.A total of 12 kinds of resistant genes were amplified with the percentage of blaCMY-2 87.88%,qnr 17.24%, aac (6′) -Ib-cr 86.21%,tetA 45%,tetB 20%,aph (3)Ⅱ 100%,aac (3) Ⅱ 10%,aadA120%,sul2 100%,and tetC,tetG and blaTEM-1 were not detected.These results showed that theSalmonellaisolated from geese,bar-headed geese and swans were seriously resistant to antimicrobials.

Salmonella;antimicrobial resistance;resistance genen

2016-08-20

四川省科技廳應用基礎研究項目(2013JY0045)

葛潤洲(1992-)，男，安徽巢湖人，碩士研究生，主要從事動物傳染病的診斷與防控研究。*

S852.612

:A

:1007-5038(2017)09-0049-06