趙 謙，王 蕾，査星琴，楊貴樹(shù)，尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南楚雄 675000)

云南省部分地區(qū)種公豬精液攜帶繁殖障礙性病毒調(diào)查研究

趙 謙1，王 蕾2，査星琴1，楊貴樹(shù)1，尹革芬1*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南楚雄 675000)

為了解云南省部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)種公豬精液繁殖障礙病毒性病原的感染狀況,應(yīng)用PCR對(duì)2014年—2016年間云南省部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)212份種公豬精液進(jìn)行了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬細(xì)小病毒(PPV)5種與豬繁殖障礙有關(guān)的病原檢測(cè)。結(jié)果表明，PPRSV陽(yáng)性率為7.08%，CSFV陽(yáng)性率為3.77%，PCV2陽(yáng)性率為6.60%，PRV陽(yáng)性率為3.30%，沒(méi)有檢測(cè)出PPV，PRRSV和PCV2的感染率呈上升趨勢(shì)，其他疫病保持相對(duì)平穩(wěn)態(tài)勢(shì)。所有的混合感染樣品中，均檢測(cè)出了PRRSV，其中PRRSV和PCV2的混合感染最為常見(jiàn)。結(jié)果提示，控制豬場(chǎng)疫病發(fā)生的關(guān)鍵是控制PRRSV和PCV2的流行，有必要加強(qiáng)對(duì)種豬群的疫病病毒檢測(cè)，推行種豬場(chǎng)主要疫病的控制與凈化工作。

種公豬；精液；繁殖障礙，病原調(diào)查

近年來(lái)，隨著農(nóng)牧業(yè)飛速發(fā)展和生豬養(yǎng)殖業(yè)的不斷擴(kuò)大，優(yōu)良種豬跨地區(qū)交易頻繁，促進(jìn)了生豬生產(chǎn)的良種化發(fā)展，使豬場(chǎng)的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益得到了很大的提高[1]。然而，生豬頻繁的交易、疫苗和各類(lèi)抗生素及藥物的濫用，使得生豬疫病的流行與發(fā)病日益嚴(yán)重化、復(fù)雜化。種豬引進(jìn)的同時(shí)，也增加了傳染性疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)[2]。特別是一些病毒性疾病能夠通過(guò)種公豬精液進(jìn)行垂直傳播[3]，不僅能夠引起母豬繁殖障礙，對(duì)豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重制約了生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。種公豬在感染某些疫病后可在其精液中檢測(cè)到相應(yīng)病原(如寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒、支原體等)，帶毒公豬通過(guò)交配將病原傳給母豬，感染后的妊娠母豬經(jīng)胎盤(pán)屏障對(duì)胎兒造成垂直傳播，產(chǎn)下帶毒仔豬，從而感染健康豬群[4-5]。目前能夠引起母豬繁殖障礙性病毒主要有豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome viruse,PRRSV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)[6]。

為了解云南省部分地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)種公豬精液攜帶相關(guān)病原的感染狀況，本研究擬通過(guò)分子生物學(xué)方法，針對(duì)CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV 5種病毒進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，建立一套能夠安全、有效的檢測(cè)公豬精液帶毒的診斷技術(shù)，確定主要的公豬精液傳播性病毒性疫病，為預(yù)防和控制豬場(chǎng)繁殖障礙性疫病的發(fā)生提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 精液樣品采集自2014年—2016年間云南部分地區(qū)種豬場(chǎng)，共計(jì)212份，其中2014年采集48份，2015年采集116份，2016年采集48份。將精液反復(fù)凍融3次后，4℃、10 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清保存于液氮中備用。

1.1.2 試劑 RNAiso Plus Total RNA (批號(hào)：D9108B),寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Bioteke 細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(批號(hào)：DP1901)，百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RI Enzyme Mix、2×ES Reaction Mix、2×TransTaqHiFiPCR Super Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；異丙醇、750 mL/L乙醇、瓊脂粉、TAE緩沖液、雙蒸水、氯仿等，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照相關(guān)序列使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)所用引物，并在BLAST上進(jìn)行比對(duì)后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物儲(chǔ)存濃度為100 μmol/L，引物工作濃度為0.2 μmol/L(表1)。

1.2.2 核酸提取

1.2.2.1 RNA提取 取200 μL樣品上清，加1 000 μL RNAiso Plus，4℃靜置5 min，加入1/5 RNAiso Plus體積量的氯仿，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清留沉淀，向沉淀中加入1 mL 750 mL/L乙醇清洗沉淀，12 000 r/min離心5 min，棄上清留沉淀，RNA干燥后溶解于適量DEPC處理水中，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

表1 引物序列

1.2.2.2 DNA提取 取200 μL樣品上清，使用裂解液樣品釋放出基因組DNA，然后蛋白沉淀液沉淀去除蛋白，最后純凈的基因組DNA通過(guò)異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液，DNA提取過(guò)程嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，提取的DNA保存于-20℃。

1.2.3 目的基因片段擴(kuò)增

1.2.3.1 PRRSV和CSFV RT-PCR檢測(cè) 將上述提取出來(lái)的樣品RNA利用特異性引物對(duì)其進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄體系如下：2×ES Reaction Mix(含10×RT buffer，dNTPs) 5 μL，Easy ScriptTMⅡ RT/RI Emzyme Mix(含Rnase Inhibitor，反轉(zhuǎn)錄酶)0.5 μL，下游引物1 μL，模板RNA 3.5 μL，反應(yīng)體系為10 μL。將配制好的體系置于42℃反應(yīng)30 min，之后85℃反應(yīng)5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增體系為：Mix(含10×PCR buffer，dNTPs，TransTaq酶) 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)1 μL，總反應(yīng)體系為25 μL。PRRSV擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min ；94 ℃ 1 min, 65 ℃1 min, 72 ℃ 1 min,40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min 。 CSFV第一輪擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 50 s，34個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將所得到的第一輪產(chǎn)物稀釋300倍后，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 40 s，34個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物配制成體系后加樣到15 g/L瓊脂糖凝膠(含2 g/L EB)孔中，并在120 V電壓下進(jìn)行30 min的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

1.2.3.2 PCV2、PRV和PPV 的PCR檢測(cè) 將上述提取出來(lái)的樣品DNA利用特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：Mix(含10×PCR buffer，dNTPs，TransTaq酶) 12.5 μL，dH2O 10.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 1 μL，總反應(yīng)體系為25 μL。PCV2擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s， 60℃40 s ，72℃ 40 s，35次循環(huán)；72℃ 7 min。 PRV擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 35 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PPV擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min , 72℃ 1 min，30次循環(huán)；72 ℃ 7 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物配制成體系后加樣到15 g/L瓊脂糖凝膠(含2 g/L EB)孔中，并在120 V電壓下進(jìn)行30 min的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV的PCR檢測(cè)結(jié)果

利用特異性引物及對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)方法對(duì)采集到的212份精液進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。PRRSV的電泳結(jié)果同預(yù)期目的片段342 bp大小相符，表明部分精液樣品中PRRSV檢測(cè)呈陽(yáng)性(圖1)。在212份樣品中，其中15份樣品檢測(cè)為PPRSV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為7.08%(15/212)。

1～5.樣品；6.陰性對(duì)照；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000

1-5.Samples;6.Negative control;M.DNA Marker DL 1 000

圖1 PRRSV的PCR檢測(cè)

Fig.1 PRRSV detection by PCR

2.2 CSFV的PCR檢測(cè)結(jié)果

利用特異性引物及對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)方法對(duì)采集到的212份精液進(jìn)行CSFV檢測(cè)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。CSFV的電泳結(jié)果同預(yù)期目的片段235 bp大小相符，結(jié)果表明部分精液樣品中CSFV檢測(cè)呈陽(yáng)性(圖2)。在212份樣品中，其中8份樣品檢測(cè)為CFSV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.77%(8/212)。

1.陰性對(duì)照；2～5.樣品；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000

1.Negative control;2-5.Samples;M.DNA Marker DL 1 000

圖2 CSFV的PCR檢測(cè)

Fig.2 CSFV detection by PCR

2.3 PCV2的PCR檢測(cè)結(jié)果

利用特異性引物及對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)方法對(duì)采集到的212份精液進(jìn)行PCV2檢測(cè)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。PCV2的電泳結(jié)果同預(yù)期目的片段702 bp大小相符，表明部分精液樣品中PCV2檢測(cè)呈陽(yáng)性(圖3)。在212份樣品中，其中7份樣品檢測(cè)為PCV2陽(yáng)性，陽(yáng)性率為6.60%(14/212)。

1.陰性對(duì)照；2～6.樣品；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000

1.Negative control;2-6.Samples;M.DNA Marker DL 1 000

圖3 PCV2的PCR檢測(cè)

Fig.3 PCV2 detection by PCR

2.4 PRV的PCR檢測(cè)結(jié)果

利用特異性引物及對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)方法對(duì)采集到的212份精液進(jìn)行PRV檢測(cè)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PRV產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。PRV的電泳結(jié)果同預(yù)期目的片段303 bp大小相符，由此可以初步判定對(duì)應(yīng)精液中PRV檢測(cè)陽(yáng)性(圖4)。在212份樣品中，其中7份樣品檢測(cè)為PRV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.30%(7/212)。

2.5 PPV的PCR檢測(cè)結(jié)果

利用特異性引物及對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)方法對(duì)采集到的212份精液進(jìn)行PPV和JEV檢測(cè)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,沒(méi)有出現(xiàn)與預(yù)期目的條帶相符的條帶，表明精液樣品中沒(méi)有檢測(cè)出PPV陽(yáng)性，陽(yáng)性率均為0。

2.6 不同年份送檢樣品病原陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

1.陰性對(duì)照；2～6.樣品;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000

1.Negative control;2-6.Samples;M.DNA Marker DL 1 000

圖4 PRV的PCR檢測(cè)

Fig.4 PRV detection by PCR

共檢測(cè)的精液樣品212份中，2014年共檢測(cè)樣品48份，檢出陽(yáng)性6份，其中CSFV陽(yáng)性4份，陽(yáng)性率8.33%；PRV陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率為2.08%；PCV2陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率為2.08%，PRRSV和PPV均未檢出。2015年共檢測(cè)樣品116份，檢出陽(yáng)性15份，其中PRRSV陽(yáng)性7份，陽(yáng)性率6.0%；CSFV陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率2.6%；PRV陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率2.6%；PCV2陽(yáng)性2份，陽(yáng)性率為1.7%；PPV未檢出。2016年共檢測(cè)樣品48份，檢出陽(yáng)性23份，其中PRRSV陽(yáng)性8份，陽(yáng)性率16.7%；CSFV陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率2.1%；PRV陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率6.3%；PCV2陽(yáng)性11份，陽(yáng)性率為23.0%；PPV未檢出(表2)。

2.7 陽(yáng)性病例中混合感染病例統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2014年—2016年間，共檢出36份精液樣品呈陽(yáng)性，其中6份精液樣品檢出兩種病毒、1份精液樣品中檢出3種病毒，混合感染率為19.44%；2014年共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品6份，未發(fā)現(xiàn)混合感染；2015年共檢出陽(yáng)性樣品11份，其中PRRSV和CSFV混合感染樣品共有1份，混合感染率為9.09%；PRRSV和PRV混合感染樣品共有1份，混合感染率為9.09%；PRRSV和PCV2混合感染樣品共有2份，混合感染率為18.20%。2016年共檢出陽(yáng)性樣品19份，PRRSV和PCV2混合感染樣品共有2份，混合感染率為10.53%；PRRSV、CSFV和PCV2混合感染樣品共有1份，混合感染率為5.26%(表3)。

表2 2013年—2015年陽(yáng)性病例統(tǒng)計(jì)表

表3 陽(yáng)性病例中混合感染病例

3 討論

在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，通過(guò)引進(jìn)優(yōu)良種公豬或種公豬精液不僅是豬種改良的重要手段，而且也是提高豬場(chǎng)生產(chǎn)效率的重要方式[7]。然而，引進(jìn)種公豬或者種公豬精液的過(guò)程中，也增加了動(dòng)物疫病的傳播。尤其是一些能夠引起繁殖障礙的病毒性疾病，已經(jīng)成為困擾養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。目前很多研究已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注種公豬精液攜帶病毒可能給規(guī)?；i場(chǎng)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)精液攜帶病毒的情況進(jìn)行了調(diào)查。其中張志等[8]針對(duì)山東種公豬精液的調(diào)查結(jié)果表明，公豬精液攜帶病原現(xiàn)象較為嚴(yán)重，35份精液樣品的PRRSV檢出率為29.6% ，CSFV的檢出率為11.4%，PCV2的檢出率為14.3%，PRV的檢出率為2.9%。相對(duì)于山東的調(diào)查結(jié)果，來(lái)自廣西的數(shù)據(jù)顯示[6]，廣西種公豬精液帶毒現(xiàn)象更為嚴(yán)重，5種主要的豬繁殖障礙性病毒性病原均有檢出，248份精液樣品檢出PRRSV陽(yáng)性率為48.39%，CSFV的陽(yáng)性率為16.94%，PCV2的陽(yáng)性率3.23%，PRV的陽(yáng)性率5.24%，PPV的陽(yáng)性率42.34%。本研究針對(duì)來(lái)自云南不同豬場(chǎng)的212份精液進(jìn)行的5種主要繁殖障礙性病原檢測(cè)結(jié)果顯示，PRRSV、CFSV、PRV、PCV2的陽(yáng)性檢出率分別為7.08%、3.77%、3.30、6.60%，暫時(shí)未見(jiàn)豬PPV的檢出。同其他研究一樣，PRRSV的檢出率最高。本研究在2014年—2016年間對(duì)相同豬場(chǎng)進(jìn)行了3年的持續(xù)性檢測(cè)，結(jié)果表明2014年間，CSFV的檢出率最高，共檢出8份，達(dá)到8.33%；PRV和PCV2陽(yáng)性率均為2.08%，而PRRSV和PPV均未檢出。2015年間，PRRSV檢出陽(yáng)性7份，陽(yáng)性率6.0%；CSFV陽(yáng)性3份次，陽(yáng)性率2.6%；PRV陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率2.6%；PCV2陽(yáng)性2份，陽(yáng)性率為1.7%；PPV未檢出。2016年共檢測(cè)樣品48份，檢出陽(yáng)性23份次，其中PRRSV陽(yáng)性8份，陽(yáng)性率16.7%；CSFV陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率2.1%；PRV陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率6.3%；PCV2陽(yáng)性11份，陽(yáng)性率為23.0%；PPV未檢出。結(jié)果提示，云南省種公豬精液也存在攜帶多種繁殖障礙性病毒的情況，相對(duì)于其他地區(qū)，云南省種公豬精液病原檢出率相對(duì)較低；2014年—2015年間，PRRSV和PCV2的感染率呈逐年上升趨勢(shì)，而其他疫病保持平穩(wěn)態(tài)勢(shì)，控制豬場(chǎng)疫病發(fā)生的關(guān)鍵，首先是控制PRRSV和PCV2的流行趨勢(shì)。

隨著規(guī)?；B(yǎng)豬水平的提高，豬繁殖障礙性疫病在臨床上發(fā)生了新變化，隱性感染和亞臨床病例顯著上升，持續(xù)性和混合感染在豬群中較為普遍，臨床癥狀日趨復(fù)雜[9]。本研究在2014年—2016年間，共檢測(cè)出36份陽(yáng)性樣品，混合感染樣品共有7份，混合感染樣品占陽(yáng)性樣品數(shù)的19.44%，和吳永剛等[10]調(diào)查結(jié)果相似；其中2014年未發(fā)現(xiàn)混合感染；2015年發(fā)現(xiàn)PRRSV和PCV2混合感染率為9.09%，PRRSV和PRV混合感染率為9.09%；PRRSV和PCV2混合感染率為18.20%。2016年P(guān)RRSV和PCV2混合混合感染率為10.53%；PRRSV、CSFV和PCV2混合感染感染率為5.26%。結(jié)果提示，所有的混合感染樣品中，均檢測(cè)出了PRRSV，其中PRRSV和PCV2的混合感染最為常見(jiàn)。兩種病毒均能夠抑制宿主免疫，增加其他病原體感染機(jī)會(huì)，造成免疫失敗，導(dǎo)致混合感染的程度逐年提高[11-12]。

總之，云南省部分地區(qū)的種公豬精液存在攜帶多種繁殖障礙性病毒病原的情況，盡管檢測(cè)陽(yáng)性率相對(duì)較低，但是PRRSV和PCV2的感染率呈逐年上升趨勢(shì)，多種病毒混合感染日趨復(fù)雜。因此，在當(dāng)前豬病防控的嚴(yán)峻形勢(shì)下，有必要加強(qiáng)對(duì)種豬群的疫病檢測(cè)，推行種豬場(chǎng)主要疫病的控制與凈化工作勢(shì)在必行。

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InvestigationonPorcinePeproductiveVirusesfromBoarSemeninYunnanProvince

ZHAO Qian1, WANG Lei2, ZHA Xing-qin1, YANG Gui-shu1,YIN Ge-fen1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China; 2.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofChuxiong,Chuxiong,Yunnan,675000,China)

In order to investigate the viral infection situations in some areas in Yunnan province,the detection of five production related viruses from 212 boar semen by polymerase chain reaction (PCR) was performed,including porcine repeproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),classic swine fever virus (CSFV),pseudorabies virus (PRV),porcine circovirus type virus Ⅱ(PCV2) and porcine parvovirus (PPV).The results showed that the PPRSV positive rate is 7.08%;the CSFV positive rate is 3.77%;the PCV2 positive rate is 6.60% and the PRV positive rate is 3.30%,while no PPV positive semen was detected.The rates of PRRSV and PCV infection increased year by year,and the infection rates for the other two viruses have been relatively stable.The PRRSV were detected from all the multiplex infection samples.Among them,the mixed infection of PRRSV and PCV2 is most common.Our data implied that controlling PRRSV and PCV2 is the key to prevent swine diseases.It is necessary to strengthen the disease detection for breeding herd and to purify the main breeding pig farm.

boar;semen;reproductive disorder;pathogenic investigation

2017-01-06

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2016FA018)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560705)

趙 謙(1992-)，男，云南大理人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病及分子流行病學(xué)研究。*

S852.852.651;S858.28

:A

:1007-5038(2017)09-0037-06