鄭國英，馬玉馨，李太仙 ，尹海英，邵慶勇，信愛國， 高華峰*，李志明*

(1.昆明市西山區(qū)農(nóng)林局，云南昆明 650100；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南昆明 650024； 3. 云南農(nóng)業(yè)大學，云南昆明 650201； 4. 昆明市西山區(qū)海口街道辦事處，云南昆明 650114)

昆明市西山區(qū)山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定

鄭國英1，馬玉馨2,3，李太仙4，尹海英1，邵慶勇2，信愛國2， 高華峰2*，李志明1*

(1.昆明市西山區(qū)農(nóng)林局，云南昆明 650100；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南昆明 650024； 3. 云南農(nóng)業(yè)大學，云南昆明 650201； 4. 昆明市西山區(qū)?？诮值擂k事處，云南昆明 650114)

羊偽結(jié)核病是山羊一種慢性消耗性細菌病，對山羊養(yǎng)殖業(yè)的危害極大。為控制本病的發(fā)生，從2016年期間，對昆明市西山區(qū)存欄的38 225只山羊開展流行病學調(diào)查，結(jié)果表明偽結(jié)核病在西山區(qū)山羊平均發(fā)病率為10.3%，病死率0.1%，采集病料經(jīng)細菌分離鑒定、小鼠毒力試驗、16 S rRNA序列分析比較及藥敏試驗，結(jié)果表明，引起本病的病原菌鑒定為山羊偽結(jié)核棒狀桿菌，對其中2個菌株完成了生化鑒定及藥敏試驗分析。生化及16 S序列分析結(jié)果表明，分離菌株為羊偽結(jié)核棒狀桿菌，對完成系統(tǒng)鑒定的2株細菌完成藥敏試驗，結(jié)果表明，除鏈霉素、甲硝唑及復方新諾明外的大多數(shù)抗菌藥物均對其敏感，可為該地區(qū)及昆明其他疫區(qū)臨床用藥提供參考。

羊偽結(jié)核??；流行病學；分離鑒定；藥敏試驗

2005年以來在昆明西山區(qū)發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖山羊中出現(xiàn)一種潛在的、造成經(jīng)濟損失很大的消耗性疾病，其表現(xiàn)是羊體內(nèi)外生長膿皰，此后逐年遞增，初步調(diào)查表明羊發(fā)病率為10.3%，病死率0.1%。該病主要通過動物與動物之間的接觸傳播，給西山區(qū)羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。 初步研究表明，困擾養(yǎng)羊戶多年的羊局部膿灶的主要病原為偽結(jié)核棒狀桿菌引起的偽結(jié)核病，對山羊危害較大，也是一種人畜共患慢性傳染病。本病是國際上公認的難以防控的傳染病之一，侵入羊群則很難徹底清除，給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成較大危害[1-2]。我們對昆明市西山區(qū)進行了系統(tǒng)的流行病學調(diào)查，并完成對分離菌株的生化及分子生物學鑒定，對分離菌株完成藥敏試驗，以期弄清本地區(qū)偽結(jié)核病流行規(guī)律，通過對分離菌株完成細菌16 S rRNA基因序列測定，比較本地區(qū)流行菌株16 S rRNA基因的變異情況，并在此基礎(chǔ)上對部分典型菌株完成全基因組分析比較，并為將要開展的疫苗研究，病原及血清學診斷方法研究提供研究基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上制定綜合防控措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羊偽結(jié)核病流行病學調(diào)查及病料采集 從昆明市西山區(qū)所有山羊養(yǎng)殖戶進行入戶調(diào)查，2016年期間，通過村防疫員及獸醫(yī)站以問卷的形式對西山區(qū)621戶養(yǎng)羊戶羊存欄總數(shù)、偽結(jié)核病發(fā)病總數(shù)、死亡總數(shù)、歷史發(fā)病情況及發(fā)病的治療及處理情況各項指標逐一調(diào)查，對部分體表有膿包的成年山羊，在屠宰場調(diào)查其內(nèi)臟組織病變情況。其余指標主要包括主要流行疫病包括口蹄疫、小反芻獸疫、傳染性胸膜炎、三聯(lián)四防疫苗及羊痘的免疫及本地區(qū)是否有其他不明原因山羊流行病的發(fā)生。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 營養(yǎng)脂培養(yǎng)基、 血清肉湯培養(yǎng)基、2×TaqPCR Mix，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；小牛血清，昆明貝爾吉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物 38只昆明種小鼠，隨機分成18組，其中一組為對照，每組2只，另設(shè)對照組1組，待小鼠適應3 d后進行注射細菌液體培養(yǎng)物，每只小鼠注射0.5 mL,對照組注射0.5 mL生理鹽水。逐日觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離鑒定 將采集的18份膿汁無菌操作接種于血清瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h～24 h后進行菌落觀察,并涂片、革蘭染色、鏡檢。根據(jù)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和染色特性初步判定細菌種屬，而后將典型菌落接種培養(yǎng)基二次純化培養(yǎng)，18 h～24 h后鏡檢觀察,細菌單克隆液體純培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯,進行增殖培養(yǎng),以進行生化鑒定。

1.2.2 樣品DNA提取 細菌基因組DNA提取，參照說明書提取后置-20℃保存。

1.2.3 細菌16 S rRNA基因的擴增、測序及分析 以細菌基因組提取試劑盒分別提取分離菌的基因組DNA,以16 S rDNA通用引物(F27 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;F1492 5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) 片段長度 1 465 bp[3-4]。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。用上述引物對提取的基因組DNA同時進行PCR擴增，反應體系(25 μL)為：PremixTaq12.5 μL,上下游引物分別為0.5 μL, 模板DNA(20 ng/μL),滅菌蒸餾水補至25 μL。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；50℃ 40 s,72℃ 90 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。反應結(jié)束后，用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序，所得序列與GenBank中細菌16 S rRNA基因序列進行比較。

1.2.4 生化鑒定 取純培養(yǎng)的單個菌落培養(yǎng)于血清培養(yǎng)皿內(nèi)，按照API Coryne棒狀桿菌試劑盒說明(購自法國梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司)，取OD=6.0的細菌分別接種于硝酸鉀、吡嗪酰胺、焦谷氨酸-β-萘胺、2-萘基-磷酸鹽、萘酚-ASBI-葡萄糖醛酸、2-萘基-βD-吡喃(型)半乳糖苷、2-萘基-αD-吡喃(型)葡萄糖苷、1-萘基-N-乙?；?βD-氨基葡糖苷、七葉靈/檸檬酸鐵、尿素、明膠、陰性控制、D-葡萄糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露醇、D-丙二酸鹽、D-乳糖(牛源) 、糖原、七葉靈或明膠的細菌生化鑒定板中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，按要求加入相應試劑，通過細菌鑒定系統(tǒng)軟件讀取判定結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗 對具有典型特征的4株分離菌株，制備0.5麥氏濁度試驗菌懸液，吸取200 μL均勻涂布于直徑90 mm的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，放置6片抗菌藥物藥敏紙片，倒置在培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，測定抑菌圈直徑，判斷耐藥(R)，高敏(S)和中敏(I)。

2 結(jié)果

2.1 流行病學調(diào)查結(jié)果

對西山區(qū)轄區(qū)內(nèi)涉及養(yǎng)殖羊的碧雞、海口、團結(jié)街道辦事處及西山風景區(qū)管理局貓貓箐居委會共621戶，逐一檢查38 225只羊的體表，結(jié)合調(diào)查表回收的方式，了解該病羊發(fā)病時間、數(shù)量、品種、日齡和季節(jié)以及發(fā)病病程、臨床表現(xiàn)(表1和表2)。

表1 偽結(jié)核病發(fā)病羊只調(diào)查統(tǒng)計表

由表1可見，621養(yǎng)羊戶中有272戶的羊只有體表內(nèi)外生長膿包的現(xiàn)象，發(fā)病戶占總戶數(shù)的43.8%。普查38 225只羊，共查出病羊3 942只，平均發(fā)病率為10.3%，病死率低，占0.1%。發(fā)病羊只以成年羊只為主，2月齡以下的羔羊不發(fā)病，2月齡至1歲以內(nèi)的羊散發(fā)。羊局部膿灶主要分布在體表，占99.8%。內(nèi)臟型占0.13%，混合感染占0.025%，內(nèi)臟型與混合型的發(fā)病率較低。

由表2可見，莎能羊發(fā)病率為19.65%，更易感。山羊發(fā)病率8.89%，綿羊未見感染。臨床表現(xiàn)為羊只體表內(nèi)外膿腫，最早3 d，最晚15 d～20 d可見體表明顯腫塊。

2.2 細菌分離株的形態(tài)和培養(yǎng)特征

膿汁和培養(yǎng)物的涂片染色鏡檢，可見G+球桿狀、棒狀和少量絲狀桿菌，無芽胞和莢膜，抗酸染色陰性。血清瓊脂平板和鮮血瓊脂平板上菌落白色，部分偏黃，干燥、凸起、不透明。菌落周圍有狹窄的β溶血環(huán)；麥康凱平板上不生長；普通瓊脂平板上生長貧瘠。血清肉湯在24 h后混濁，且有白色菌膜出現(xiàn)。

2.3 PCR 鑒定及序列分析

4株分離菌株P(guān)CR擴增獲得與預期相符的條帶，分別為1 465 bp(圖1)：去除前面引物序列后，經(jīng)Blast在線分析比對，4株分離菌16 S rRNA序列與GenBank已收錄的偽結(jié)核棒狀桿菌(CD070,登錄號NR-117210.1)相應的基因序列同源性最高，均為100%，表明細菌的16 S rRNA序列較為穩(wěn)定，所有菌株未產(chǎn)生基于16 S rRNA的變異。

2.4 生化鑒定結(jié)果

2株分離菌株KM-1及KM-2純培養(yǎng)皿中的細菌，按梅里埃棒狀桿菌鑒定要求收集細菌達到OD=6.0接種后培養(yǎng)24 h，加入試劑盒中相應化學試劑，通過系統(tǒng)鑒定與標準符合度為99.1%，詳細結(jié)果見表3，最終判定為偽結(jié)核棒狀桿菌。

表2 不同品種羊偽結(jié)核病發(fā)病情況

2.5 致病性試驗

將38只昆明種分成19組，每組2只，待小鼠適應3 d后進行腹腔注射，取新鮮血清肉湯培養(yǎng)物以每只小鼠注射0.5 mL劑量,分離菌株在注射的2 d～4 d內(nèi)除1只外,全部死亡,對照組無異常反應,表明所有分離菌株有較強毒力。

M.DNA標準DL 2 000;1～4.分離菌株P(guān)CR；5.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1-4.PCR products of 16 S rRNA；5.Negative control

圖1偽結(jié)核桿菌16 S rRNA PCR鑒定

Fig.1 PCR identification of 16 S rRNA ofCorynebacteriumpseudotuberculosis

表3 偽結(jié)核棒狀桿菌生化鑒定表

續(xù)表3

試驗Test底物Substrate劑量/mgQTY反應酶Reactioneznzyme結(jié)果ResultsRIBXYLD?核糖D?ribose1．4發(fā)酵(核糖)Fermentation(ribose)+MAND?木糖D?xylose1．4發(fā)酵(木糖)Fermentation(xylose)-MALD?甘露醇D?mannitol1．36發(fā)酵(甘露醇)Fermentation(Mannitol)+LACD?丙二酸鹽D?malonate1．4發(fā)酵(丙二酸鹽)Fermentation(Malonate)-SACD?乳糖(牛源)D?lactose(Cattle)1．4發(fā)酵(糖原)Fermentation(Glycogen)-GLYG糖原Glycogen1．28發(fā)酵(乳糖)Fermentation(Lactose)-CAT七葉靈或明膠Svenleavesorgelatin-觸酶Catalase-

2.6 藥敏試驗

2株偽結(jié)核棒狀桿菌KM-1和KM-2藥敏試驗表明，此次分離菌對多種藥物均表現(xiàn)敏感，頭孢噻肟/棒酸、慶大霉素、恩諾沙星等16種抗菌藥物高敏，但對復方新諾明、鏈霉素、甲硝唑等7種藥物表現(xiàn)抗性，詳細抗性分類見(表4)。

表4 偽結(jié)核棒狀桿菌藥敏試驗

注：≥15 mm以上高敏,10 mm～14 mm中敏，≤10 mm以下不敏感。

Note：≥15 mm is sensitive,10 mm～14 mm is intermediate，≤10 mm is resistant.

3 討論

偽結(jié)核棒狀桿菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，主要感染綿羊和山羊，引起的疾病稱為羊干酪性淋巴結(jié)炎(偽結(jié)核病)，在疾病的臨床表現(xiàn)方面，其主要特點是淋巴結(jié)化膿，本病目前在世界范圍內(nèi)廣泛流行，國內(nèi)也有很多本病的報道，但未見區(qū)域性流行病學研究，本研究對昆明地區(qū)偽結(jié)核病進行了全群調(diào)查，結(jié)果表明昆明市西山區(qū)自2005年首次發(fā)現(xiàn)本病，2012年—2015年呈暴發(fā)流行，本病已成為昆明地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)中一種潛在的、造成嚴重經(jīng)濟損失的消耗性疾病，其平均發(fā)病率為10.3%，病死率為0.1%。發(fā)病率與年齡關(guān)系密切，發(fā)病羊只以成年羊只為主，2月齡以下的羔羊不發(fā)病。 綿羊暫時未見感染，這情況與楊雪紅等[1-2]報道的綿羊為易感動物的情況有差異，主要原因可能是綿羊飼養(yǎng)量及規(guī)模較小，本次流行病學調(diào)查也表明不同品種、性別的山羊均易感，奶山羊更易感染，這與農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖過程中擠奶環(huán)節(jié)不注意衛(wèi)生直接相關(guān)。此外，在本次調(diào)查過程中，羊偽結(jié)核棒狀桿菌感染未見明顯季節(jié)變化，一年四季均可發(fā)生，全群感染康復后發(fā)病率會明顯降低。羊局部膿灶常見于體表，內(nèi)臟和混合較為少見，調(diào)查表明除心臟未見長膿腫外，內(nèi)臟器官均見過膿腫。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)昆明地區(qū)自2005年發(fā)現(xiàn)羊偽結(jié)核病至今，難以根除的主要原因之一是養(yǎng)殖戶對該病的危害認識不足，未對病羊采取隔離治療，因該病致死率極低，便疏于治療，讓膿腫自行破潰愈合，致使含大量病原菌的膿汁隨病羊的走動污染圈舍、放牧場所，同時因該地區(qū)飼養(yǎng)方式為放牧，難以建立健全的消毒制度而使病原菌長期存在。

對羊偽結(jié)核病的診斷方面，由于臨床癥狀明顯，很容易做出診斷，但也有少量隱性感染者可繼發(fā)感染，需要實驗室診斷，細菌鑒定包括傳統(tǒng)的形態(tài)學檢查、分離培養(yǎng)、生化鑒定、免疫分析等多種方法，其中細菌的分離培養(yǎng)最為關(guān)鍵，近年來，各種基因診斷技術(shù)在細菌檢測中不斷開發(fā)、利用，尤其是基于聚合酶鏈反應(PCR)的基因診斷技術(shù)發(fā)揮著越來越重要的作用。通過傳統(tǒng)的細菌分離鑒定獲得純培養(yǎng)后，利用分子生物學技術(shù)建立對該病快速而特異的診斷方法,并在此基礎(chǔ)上分析其序列變異，本研究表明通用引物能夠快速敏感完成細菌種屬鑒定[4-5]，序列比對未見有任何變異出現(xiàn)，表明16 S rRNA高度保守,昆明市西山區(qū)發(fā)現(xiàn)的偽結(jié)核病局部流行毒株與GenBank收錄的山羊菌株序列高度一致。

羊偽結(jié)核病是國際公認的難以凈化的動物疫病，本病國內(nèi)也不同程度發(fā)生[6-8]，難于防治的重要原因是膿腫表面包有一層厚而致密的纖維性肉芽腫性包囊, 致使藥物難以通過這層包囊滲入其內(nèi)發(fā)揮作用，因而全身用藥效果不佳，局部用藥手續(xù)繁瑣，難于根除[9-10]。通過優(yōu)化抗菌藥物合理用藥方案可減少抗菌藥物的濫用及耐藥菌的生成，本研究在藥敏試驗的基礎(chǔ)上，篩選出敏感抗菌藥物用于臨床治療，對篩選出的高敏抗菌藥硫酸慶大霉素及氟苯尼考采用早期封閉注射，對晚期病例采用手術(shù)治療，清洗消毒后外敷油劑青霉素，并對農(nóng)戶養(yǎng)殖山羊全群用聚維酮碘溶液帶羊消毒，并對周圍環(huán)境用苯扎溴銨溶液消毒，防控過程中，篩選出的高敏抗菌藥對出現(xiàn)明顯偽結(jié)核病癥狀的山羊無明顯治療效果，但通過手術(shù)治療及環(huán)境消毒，減輕并控制了本病的發(fā)生及流行，取得了較好的綜合防控效果。

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IsolationandIdentificationofGoatCorynebacteriumpseudotuberculosisinXishanDistractKunming

ZHENG Guo-ying1,MA Yu-xin2,3,LI Tai-xian4,YIN Hai-ying1,SHAO Qing-yong2,XIN Ai-guo2, GAO Hua-feng2,LI Zhi-ming1

(1.BureauofXishanAgricultureandForester,Kunming,Yunnan,650100,China;2.InstituteofYunnanAnimalScienceandVeterinary,Kunming,Yunnan,650224,China;3.YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China; 4.NeighborhoodOfficesofHaikouStreet,XishanDistractKunmingCity,Kunming,Yunnan,650114,China)

Caseous lymphadenitis (CLA) is a chronic,pyogenic,contagious disease of goat that imposes considerable economic losses for farmers which is caused byCorynebacteriumpseudotuberculosis.To control the epidemiology of this disease,we carried out a survey about the epidemiology of this disease in Xishan distract Kunming city during 2016.The results showed that 10.3% of total sheep and goats were infected and the mortality was 0.1%.Bacteria were isolated and identification by DNA 16S PCR and bacterial biochemical identification and finally identificated asCorynebacteriumpseudotuberculosis.The antibacterial resistance of 4 strains to 36 drugs were determined by the methods of disk diffusion and serotypes were tested using glass plate agglutination.The results showed thatCorynebacteriumpseudotuberculosiswas sentisitive to most antimicrobials but had a high resistance to trimethoprim and metronidazole.This results will help to cure the disease in early stage in Kunming area.

Corynebacteriumpseudotuberculosis; epidemiology; isolation and identification; drug susceptibility test

2017-01-03

昆明市西山區(qū)2016年度科技項目；國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-39)

鄭國英(1968-)，女，云南昆明人，高級獸醫(yī)師，主要從事動物傳染病診斷及防控工作。*

S858.27

:A

:1007-5038(2017)09-0032-06