白艷艷,張 斌,郝玉青 ,高 艷,劉萬華,白崇生,劉健鵬*,韓 斌，楊德全

(1.榆林市動物疫病預防控制中心,陜西榆林 719000；2.榆林市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,陜西榆林 719000；3.上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

山羊痘病毒PCR檢測方法的建立及應用

白艷艷1△,張 斌2△,郝玉青1,高 艷1,劉萬華1,白崇生1,劉健鵬1*,韓 斌1，楊德全3

(1.榆林市動物疫病預防控制中心,陜西榆林 719000；2.榆林市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,陜西榆林 719000；3.上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

為了更快、更準確的診斷山羊痘(Goat pox)，根據GenBank上已公布的山羊痘病毒(GTPV)的基因序列，針對p32基因的保守序列設計并合成一對能特異性擴增山羊痘病毒的引物，擴增產物大小約為983 bp。經過反應條件的優(yōu)化，建立了山羊痘病毒PCR檢測方法，對所建立的PCR反應體系的特異性和靈敏性進行了評價，并用此方法對9份臨床樣品進行了檢測。結果顯示,該診斷方法與3種非羊痘病毒不發(fā)生交叉反應。該方法最低濃度檢測限為0.4 pg。在檢測的臨床樣品中，GTPV陽性有3 份。結果表明,所建立的方法具有良好的特異性和敏感性，適合臨床診斷應用。

山羊痘；聚合酶鏈反應；敏感性；特異性

山羊痘(Goat pox)是由山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)引起的一種以發(fā)熱、無毛或少毛部位皮膚出現(xiàn)痘疹為特征的急性、熱性、高度接觸性傳染病，在世界許多國家和地區(qū)發(fā)生和流行，造成巨大的經濟損失。被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1-4]。

近年來，山羊痘主要發(fā)生在我國的山東、內蒙古、黑龍江、甘肅、寧夏、青海等省區(qū)，呈地方流行特點，危害很大，嚴重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展[5]。榆林市是陜西省主要養(yǎng)羊區(qū)，養(yǎng)殖量占全省總量的60%，以養(yǎng)殖陜北白絨山羊為主，其養(yǎng)殖量占陜西省總量的90%以上，羊絨產量占全省總量的93%，白絨山羊養(yǎng)殖已經成為榆林市農村農民的主要收入來源。近年來，由于榆林市養(yǎng)羊數量的增加，與此同時疫病的發(fā)生也有所增加，有些縣區(qū)時有羊痘的發(fā)生，給我市養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展帶來了極大的損失。由于榆林地區(qū)實驗室條件及診斷方法相對落后，對陜北白絨山羊羊痘診斷主要依靠臨床癥狀進行判斷，易造成誤診。因此，急需建立適合本地區(qū)實驗室條件的檢測方法。本研究針對羊痘病毒P32基因序列中保守的區(qū)域設計引物，建立了快速檢測羊痘病毒核酸的PCR，為實驗室診斷提供科學準確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與病料 羊痘疫苗(批號：201609)，哈藥集團生物疫苗有限公司產品；羊痘疑似病料樣品共9份(全血，血清和痘痂樣品各3份)。

1.1.2 試劑 PCR Pre-mix、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit ver.4.0，寶生物工程(大連)有限公司產品； DNA Marker，南京上高生物公司產品；引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據參考文獻[6-7]以及GenBank中公布的山羊痘病毒p32基因序列，應用Primer 5.0引物設計軟件，設計一對特異性引物，預期擴增片段大小為983 bp。上游引物CACCGAATTCACCATGGCAGATATCCCATTATAT；下游引物GATGGCGGCCGCAACTATATACGTAAATAAC；用ddH2O稀釋到25 pmol/L， 置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山羊痘 DNA的提取 取200 μL羊痘疫苗懸液，按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit ver.4.0試劑盒說明書，提取山羊痘病毒基因組DNA。提取的DNA置-20℃保存。

1.2.3 PCR擴增 將提取的DNA進行PCR擴增，反應體系為25 μL，其中PCR Pre-mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，補足ddH2O至25 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min； 94℃ 1 min，50℃～55℃ 1 min，72℃ 2 min， 30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃結束反應。反應結束后對PCR產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。

1.2.4 特異性試驗 選取羊痘疫苗、羊口瘡疫苗、水皰性口炎疫苗、口蹄疫疫苗，按照上述方法提取DNA，進行PCR擴增，對該方法的特異性進行驗證。

1.2.5 靈敏度試驗 將0.5 mL羊痘疫苗按上述方法提取DNA，用核酸測定儀測定所提取DNA的濃度，然后進行10倍系列稀釋，各取1 μL進行PCR擴增，對其靈敏度進行檢測。

1.2.6 臨床樣品檢測 選取疑似羊痘臨床樣品的全血，血清和痘痂樣品9份進行基因組DNA的提取，然后按照上述方法PCR擴增進行山羊痘的診斷。

2 結果

2.1 PCR方法的建立

對退火溫度、引物濃度等反應參數進行比較優(yōu)化，結果顯示，以退火溫度為50 ℃，引物濃度為100 nmol/L，反應條件為預變性95℃ 5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，擴增30個循環(huán)，檢測結果最佳(圖1)，將得到的目的條帶送上海桑尼生物科技公司測序，序列結果如圖2，與GTPV疫苗株(AY881707)相比，核苷酸同源性100%(圖2)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照；2.PCR擴增產物

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.PCR amplification products

圖1 PCR擴增結果

Fig.1 PCR amplification results

圖2 GTPV p32基因序列

2.2 PCR的特異性

用相同的方法提取羊痘疫苗、羊口瘡疫苗、水皰性口炎疫苗、口蹄疫疫苗的DNA，并以此為模板進行PCR擴增，用10 g/L的瓊脂糖進行凝膠電泳，只有羊痘病毒疫苗擴增出一條約983 bp的片段，與預期結果相一致(圖3)。而羊口瘡疫苗、水皰性口炎疫苗、口蹄疫疫苗均未擴增出條帶，表明該方法所擴增的片段為羊痘病毒的特異性片段。

2.3 PCR的靈敏度

將0.5 mL羊痘疫苗按上述方法提取DNA，用核酸測定儀測定所提取DNA的濃度為40 ng/mL，然后進行10倍系列稀釋，各取1 μL進行PCR擴增檢測，結果稀釋到10-5(0.4 pg)仍可檢測出條帶，說明該方法具有較高的靈敏度(圖4)。

1.羊痘疫苗；2.羊口瘡疫苗；3.水皰性口炎疫苗；4.口蹄疫疫苗；M.DNA標準DL 2 000;

1.GPTV vaccine;2.ORFV vaccine;3.Vesicular stomatitis virus vaccine;4.FMDV vaccine;M.DNA Marker DL 2 000;

圖3特異性試驗結果

Fig.3 Specificity test results

2.4 臨床樣品檢測

選取臨床疑似羊痘羊的全血、血清和痘痂樣品9份進行基因組DNA的提取，然后按照上述方法PCR擴增(圖5)。全血和血清共6份樣品均未擴增出983 bp的特異性條帶，而3份痘痂樣品擴增出983 bp羊痘病毒的特異性條帶，說明該方法可用于臨床診斷。

M.DNA 標準DL 2 000;1～6.羊痘的DNA含量從40 ng/mL遞減稀釋到10-6

M.DNA Marker DL 2 000;1-6.The content of DNA was decreasing diluted from 40 ng/mL to 10-6

圖4靈敏度試驗結果

Fig.4 Sensitivity test results

M.DNA 標準DL 2 000;1～3.全血樣品；4～6.血清樣品；7～9.痘痂樣品；10.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.Blood samples;4-6.Serum samples;7-9.Scab samples;10.Negative control

圖5臨床疑似樣品的檢測結果

Fig.5 Detection results of clinically suspected samples

3 討論

山羊痘是一種危害比較嚴重的接觸性傳染病，在世界許多國家和地區(qū)發(fā)生和流行，我國許多地方呈地方性流行，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大損失，阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。榆林市是陜北白絨山羊的主產區(qū)，其陜北白絨山羊產業(yè)已成為榆林市畜牧業(yè)中的王牌產業(yè)。由于陜北白絨山羊養(yǎng)殖數量的迅猛增長和飼養(yǎng)方式的轉變，使山羊痘發(fā)生風險大大增加，山羊痘防控在陜北白絨山羊產業(yè)鏈發(fā)展過程中起著至關重要的作用。因此，建立快速診斷的方法是有效減少和控制該病發(fā)生的關鍵所在[8]。本研究方法的建立，改變了以往僅依靠肉眼觀察來診斷山羊痘的主觀性，大大減少了因主觀判斷所造成的誤差，提高了對該病診斷的科學性和準確性，為該病的科學診斷提供技術手段。

山羊痘在臨床癥狀上與羊口瘡、羊口蹄疫等非常相似，對該病的診斷必須依靠實驗室方法進行確診。而血清學試驗易出現(xiàn)交叉反應，很難區(qū)分[9]。一般來說，病毒病的確診需要進行病毒分離。一方面，山羊痘病毒的分離需要較高生物安全水平的實驗室，一般的實驗室的生物安全水平達不到要求；另一方面，山羊痘病毒在細胞上生長十分緩慢，通常培養(yǎng)10 d才能見到較好的細胞病變(CPE)。由于病毒感染的抗體應答水平較低，用血清學檢測方法檢測羊痘病毒效果不理想[5，10]。傳統(tǒng)的實驗方法耗時費力且容易出錯，因此，建立PCR檢測方法可實現(xiàn)對該病的快速、準確診斷，以便采取及時有效的防控措施。

山羊痘病毒為雙鏈DNA病毒，其p32蛋白是世界各地所有羊痘病毒毒株所共有的且特異性很強的結構蛋白?；谠搮^(qū)域的特異性和保守性，本研究針對這個區(qū)域設計特異性引物，建立了山羊痘的PCR診斷方法，結果表明,該方法具有較高的特異性和靈敏度。本方法可作為基層實驗室快速準確診斷羊痘的有效方法。

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DevelopmentandApplicationofPCRforDetectionofGoatPoxVirus

BAI Yan-yan1,ZHANG Bin2,HAO Yu-qing1,GAO Yan1,LIU Wan-hua1,BAI Chong-sheng1, LIU Jian-peng1,HAN Bin1,YANG De-quan3

(1.YulinAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Yulin,Shaanxi,719000,China; 2.YulinAnimalHealthSupervisionInstitute,Yulin,Shaanxi,719000,China； 3.ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai,201103,China)

The purpose of this study was to develop a faster and more accurate diagnostic method.Based on the published reference strains of goat pox virus(GTPV) in GenBank,a pair of primers for p32 gene sequence of GPTV specific amplification were designed and synthesized.The amplified product was approximately 983 bp.After the optimization of reaction condition,a PCR method for detection of GTPV was established and an evaluation on the specificity and sensitivity of reaction system for this method was conducted with detecting 9 clinical samples by this method.The result indicated that this diagnostic method did not generate cross reaction with three kinds of non-capripoxviruses.The minimum concentration of PCR is 0.4 pg.In the clinical samples detected,the number of positive GTPV is 3.The result showred that the method has good specificity and sensitivity,which can be suitable for clinical diagnosis.

Goat pox virus；PCR；sensitivity；specificity

2017-03-06

陜西省農業(yè)科技創(chuàng)新轉化資金項目(NYKJ-2015-023)；陜西省科技統(tǒng)籌項目(2015KTTSNY04-04)

白艷艷(1985-)，女，陜西佳縣人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病監(jiān)測、檢測和流行病學調查工作。△同等貢獻作者。*

S852.659.1;S854.43

:A

:1007-5038(2017)090-0010-04