孫美濤，梅雯，楊澤芳，丁小倩，張若鵬，張曉娟，熊偉*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖科，云南大理671000；3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南大理671000）

hMTERF3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

孫美濤1，梅雯1，楊澤芳1，丁小倩1，張若鵬2，張曉娟3，熊偉1*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖科，云南大理671000；3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南大理671000）

目的：構(gòu)建和鑒定帶3×Flag標(biāo)簽的人線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3基因（hMTERF3）真核表達(dá)載體。方法：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中hMTERF3基因序列設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從pGEM-hMTERF3重組克隆載體中擴(kuò)增出hMTERF3基因開(kāi)放閱讀框序列，經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后，連接入真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-14的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p3×FLAGCMV-hMTERF3，分別用菌落PCR、限制性核酸內(nèi)切酶分析和DNA序列分析3種方法鑒定重組子。結(jié)果：重組質(zhì)粒p3×FLAGCMV-hMTERF3經(jīng)雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定均獲得大小為1 254 bp的目的條帶，DNA序列分析和Blast序列比對(duì)結(jié)果表明該序列與GenBank中hMTERF3基因序列的同源性達(dá)到100%，插入基因的大小和方向均正確。結(jié)論：成功構(gòu)建了hMTERF3基因的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

人線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3；真核表達(dá)載體；鑒定

線(xiàn)粒體基因的表達(dá)調(diào)控與線(xiàn)粒體的功能密切相關(guān)〔1〕。人類(lèi)線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（human mito?chondrial transcription termination factor，hMTERF）是一類(lèi)由核基因組編碼，且能夠與線(xiàn)粒體DNA（mi?tochondrial DNA，mtDNA）特異結(jié)合的單體蛋白質(zhì)〔2〕。人類(lèi)MTREF蛋白家族包括4個(gè)成員，分別為MTERF1～MTERF4，各成員主要參與線(xiàn)粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程的調(diào)控〔3〕。目前，線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄終止因子僅在后生動(dòng)物及植物中存在，在真菌中仍未發(fā)現(xiàn)與其同源的蛋白質(zhì)〔4〕。

hMTERF3（human mitochondrial transcription ter?mination factor 3，hMTERF3）基因又被命名為人線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域1（mitochondrial tran?scription termination factor domain containing 1，hM?TERFD1）〔5〕。hMTERF3基因位于8號(hào)染色體（8q22.1），包含11個(gè)外顯子〔6〕。研究顯示，哺乳動(dòng)物MTERF3是一種線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)，負(fù)調(diào)控線(xiàn)粒體的DNA轉(zhuǎn)錄水平和能量生成〔7〕。hMTERF3基因拷貝數(shù)擴(kuò)增及其過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后有重要作用，但其在惡性腫瘤的作用機(jī)制還不清楚〔8〕。本實(shí)驗(yàn)擬利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）克隆hMTERF3基因編碼序列，構(gòu)建hMTERF3基因真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，以及尋找新的腫瘤基因治療靶點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和載體大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（博邁德生物技術(shù)有限公司）；重組DNA克隆載體pGEM-hMTERF3（Sino Biological公司）；真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-14由云南大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室余敏副教授贈(zèng)送。

1.2 試劑限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ（大連Takara公司）；2×Taq PCR Master Mix（Promega公司）；T4 DNA連接酶（Gene Copoeia公司）；Trans 2K DNA Maker、6×DNA Loading Buffer、DuRed核酸染料（北京全式金生物技術(shù)公司）；質(zhì)粒提取純化試劑盒（Omega公司）；DNA片段回收試劑盒（BioTeke公司）；瓊脂糖為西班牙進(jìn)口分裝；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；PCR引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成，DNA測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 儀器PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf AG公司）；BT423S型電子天平（德國(guó)Sarturios公司）；DYY-12C型電泳儀（北京六一儀器廠(chǎng)）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；TAZ-84A臺(tái)式恒溫培養(yǎng)箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠(chǎng)）；TGL-16C臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；HH-4恒溫水浴鍋（上海國(guó)華電器有限公司）；微量移液器（上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；LDZX-50FA立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）。

1.4 方法

1.4.1引物設(shè)計(jì)檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到hM?TERF3基因（Gene ID：557786089）的轉(zhuǎn)錄本，PCR引物設(shè)計(jì)參照hMTERF3基因序列完整的轉(zhuǎn)錄本1（NM_015942.4）。上游引物P1（引入HindⅢ酶切位點(diǎn)）：5'-GCGAAGCTTATGGCTTTGTCAGCCCA-3'，下游引物P2（引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)）：5'-GCGGG?TACCAAGCGTTTTTAAGAATT-3'，下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn)，之前為保護(hù)堿基。預(yù)期的DNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 254 bp。

1.4.2hMTERF3基因的PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)以重組克隆質(zhì)粒pGEM-hMTERF3為模板，用上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增hMTERF3基因，反應(yīng)體系為25 μL，其中模板DNA 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小。

1.4.3 p3×FLAG-CMV-hMTERF3真核載體的構(gòu)建與PCR鑒定將hMTERF3基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收純化后，與真核表達(dá)質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-14分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，酶切后用1%瓊脂糖凝膠電泳，并經(jīng)過(guò)凝膠回收純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將外源目的基因和真核表達(dá)載體酶切純化的產(chǎn)物按照3：1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后取200 μL菌液涂布于含氨芐青霉素100 μg∕mL的LB固體培養(yǎng)基中。次日，隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，分別接種于3 mL含50 μg∕mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中，37℃，200 r∕min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增以鑒定是否存在插入片段。菌落PCR鑒定引物為P1∕P2，反應(yīng)體系25 μL，其中菌液1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物大小。如果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確則用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。

1.4.4 p3×FLAG-CMV-hMTERF3真核表達(dá)載體的酶切鑒定和測(cè)序鑒定將提取的重組真核表達(dá)質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3同時(shí)用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將酶切鑒定正確的重組真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒的測(cè)序引物：上游引物5'-CGCAAAT?GGGCGGTAGGCGTG-3'，下游引物5'-CCAGCTTG?GTTCCCAATAGA-3'。DNA測(cè)序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1hMTERF3基因的PCR產(chǎn)物電泳分析利用PCR從pGEM-hMTERF3克隆載體擴(kuò)增得到hMTERF3基因完整的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）片段。hMTERF3基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 254 bp處可見(jiàn)清晰、單一的的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的片段大小一致。見(jiàn)圖1。

圖1 hMTERF3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的構(gòu)建目的基因和p3×FLAG-CMV-14空載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3，用空載體作為對(duì)照進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，提取質(zhì)粒的質(zhì)量良好，純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和RNA的污染。見(jiàn)圖2。

圖2 p3×FLAG-CMV-hMTERF3重組質(zhì)粒電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的鑒定重組表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3的菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在1 254 bp處可見(jiàn)一條特異性的目的條帶。見(jiàn)圖3。提取純化的重組表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)大小約為6 310 bp的載體條帶與1 254 bp的目的條帶兩個(gè)片段?？蛰d體p3×FLAG-CMV-14經(jīng)上述兩個(gè)酶雙酶切后，僅見(jiàn)一條6 310 bp的載體條帶。見(jiàn)圖4。

圖3 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3

圖4 HindⅢ∕BamHⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒p3× FLAG-CMV-hMTERF3

2.4 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的序列分析鑒定對(duì)質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3上的多克隆位點(diǎn)內(nèi)的外源DNA進(jìn)行序列分析鑒定，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast程序與GenBank檢索到的編碼序列（NM_ 015942.4）同源性為100%，說(shuō)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。見(jiàn)圖5。

3 討論

線(xiàn)粒體是細(xì)胞中的重要細(xì)胞器，細(xì)胞的能量供應(yīng)來(lái)自于線(xiàn)粒體。隨著人們對(duì)線(xiàn)粒體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制和人類(lèi)線(xiàn)粒體疾病的深入研究，對(duì)人類(lèi)MTERF蛋白家族的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)〔9-10〕。MTERF3基因是MTERF基因超家族中進(jìn)化最保守的成員，在低等的果蠅到高等的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都存在同源基因〔11〕。hMTERF3基因定位于人類(lèi)8號(hào)染色體（8q22.1），基因全長(zhǎng)22 216 bp，含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子〔6〕。hMTERF3基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物共417個(gè)氨基酸，N端1～68個(gè)氨基酸為進(jìn)入線(xiàn)粒體的導(dǎo)肽，其后349個(gè)氨基酸為成熟的hMTERF3蛋白。我們?cè)谇捌谘芯恐?，成功地在大腸埃希菌中原核表達(dá)和純化了hMTERF3蛋白，并制備了小鼠抗hMTERF3多克隆抗體。進(jìn)一步采用細(xì)胞免疫熒光的方法證實(shí)，hMTERF3蛋白定位在人宮頸癌HeLa細(xì)胞的線(xiàn)粒體上〔12〕。WRDENBERG等〔13〕的研究顯示，哺乳動(dòng)物MTERF3不僅負(fù)性調(diào)節(jié)mtDNA轉(zhuǎn)錄，而且能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體中核糖體大亞基的組裝，影響核糖體的生物合成〔7〕。HYV?RINEN等用二維瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)mtDNA復(fù)制中間體的研究發(fā)現(xiàn)，在胚腎293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hMTERF3能抑制線(xiàn)粒體DNA復(fù)制，造成細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)的下降〔13-14〕。這些結(jié)果進(jìn)一步提示，hMTERF3可能還參與抑制mtDNA復(fù)制過(guò)程中復(fù)制中間體的形成及復(fù)制叉的延伸。

圖5 Blast程序比對(duì)重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3部分測(cè)序結(jié)果

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)肝癌、胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中mtDNA含量和線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性降低，這提示惡性腫瘤中參與線(xiàn)粒體基因表達(dá)調(diào)控的蛋白因子可能存在著表達(dá)異?！?5-17〕。ZHANG等的研究表明，hMTERF3基因擴(kuò)增和表達(dá)異常與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切〔8〕。但hMTERF3基因在腫瘤細(xì)胞中具體作用機(jī)制亟待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中使用的p3×FLAG-CMV-14是一個(gè)典型的真核表達(dá)載體，能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的過(guò)表達(dá)。構(gòu)建的真核表達(dá)載體為質(zhì)粒，比病毒載體安全性更高，真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-14含有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因插入至載體〔18〕。同時(shí)，載體上含有氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和新霉素抗性基因（Neor）使得質(zhì)粒容易篩選，構(gòu)建好的重組真核表達(dá)載體能夠穩(wěn)定在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和高效表達(dá)。p3×FLAGCMV-14載體上的FLAG標(biāo)記物是專(zhuān)為標(biāo)記目的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的多肽標(biāo)記物，其特點(diǎn)是標(biāo)記物的序列不是來(lái)自任何已知的蛋白質(zhì)。該標(biāo)記物是由8個(gè)氨基酸組成的多肽，具有親水性，可以置于外源蛋白質(zhì)的羧基末端〔19〕。目前，已有商品化的FLAG抗體可識(shí)別標(biāo)記物，方便進(jìn)行外源蛋白質(zhì)的檢測(cè)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒，可為下一步研究hMTERF3基因?qū)δ[瘤細(xì)胞氧化磷酸化活性和惡性生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。

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Construction and Identification of Eukaryotic Expression Vector of Human MTERF3

Sun Meitao1,Mei Wen1,Yang Zefang1,Ding Xiaoqian1,Zhang Ruopeng2,Zhang Xiaojuan3,Xiong Wei1*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Department of Reproductive Medicine,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;3.Department of Respiratory Medicine,Dali Teaching Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To construct and identify the eukaryotic expression vector of FLAG-tagged human MTERF3 gene.Methods：The human MTERF3 gene was amplified by Polymerase Chain Reaction（PCR）.The recombinant products of the p3×FLAG-CMV-hMTERF3 were gained by T4 DNA ligase connecting MTERF3 gene fragment and eukaryotic expression vector p3×FLAG-CMV-14 with restriction enzymes HindⅢand BamHⅠ.The recombinant pasmid p3×FLAG-CMV-hMTERF3 were identified by colony PCR, double restriction enzyme digest and DNA sequencing.Results：A specific band of 1 254 bp was detected from recombinant plasmid p3×FLAG-CMV-hMTERF3 by digestion of HindⅢand BamHⅠ.The sequencing and identification showed that homology between this sequence and the human MTERF3 gene sequence from GenBank was 100%,and the size and the direction of the inserted gene were right.Conclusion：The eukaryotic expression vector of human MTERF3 was constructed successfully,which may lay the foundation for a further study of the interaction mechanism between behavior of MTERF3 in tumor cells and its development.

human MTERF3;eukaryotic expression vector;identification

Q78

A

2096-2266（2017）08-0018-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.005

（責(zé)任編輯 李楊）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31601155；81560458）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2014Z126）；大理大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（CXCY-X-2016-18）；大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX201609）

2017-01-04

2017-01-21

孫美濤，碩士研究生，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究.

*通信作者：熊偉，副教授，博士.