張曉燦，段寶忠，羅丹丹，陶愛恩，李楊

（大理大學藥學與化學學院，云南大理671000）

不同海拔粗莖秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分含量研究

張曉燦，段寶忠，羅丹丹，陶愛恩，李楊*

（大理大學藥學與化學學院，云南大理671000）

目的：探討不同海拔粗莖秦艽中環(huán)烯醚萜苷類成分，為粗莖秦艽人工種植及仿野生栽培基地選擇提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法測定不同海拔粗莖秦艽中4種活性成分的含量，同時結(jié)合化學計量學方法對其指紋圖譜進行分析。結(jié)果：26批藥材含量均符合《中國藥典》質(zhì)量規(guī)定，指紋圖譜相似度均大于0.9，隨海拔升高4種活性成分總含量呈鐘狀變化。結(jié)論：海拔2 700 m左右地區(qū)的粗莖秦艽藥材質(zhì)量較優(yōu)，建議粗莖秦艽人工種植及仿野生栽培基地選擇此海拔附近。

粗莖秦艽；海拔；環(huán)烯醚萜苷類成分

粗莖秦艽為龍膽科植物粗莖秦艽Gentiana crassicaulisDuthie ex Burk.干燥的根，具有祛風濕，清濕熱，止痹痛，退虛熱的功效〔1〕。其活性成分主要是環(huán)烯醚萜苷類，包括馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷等〔2〕。粗莖秦艽野生資源嚴重枯竭，被列為國家三級重點保護的野生藥材。藥材的生長及品質(zhì)與生態(tài)因子密切相關(guān)，已有學者研究了秦艽化學成分的積累與氣候因子具有顯著的相關(guān)性〔3〕。有關(guān)粗莖秦艽的研究方面，相關(guān)學者對其主要有效成分進行了測定〔4-7〕、同時對其品質(zhì)與栽培土壤化學因子的相關(guān)性分析〔8〕等進行了研究，但生態(tài)因子對粗莖秦艽中活性成分影響的相關(guān)研究尚未見報道。鑒于此，本實驗采用HPLC法對云南省蘭坪縣不同海拔地區(qū)粗莖秦艽中4種環(huán)烯醚萜苷類成分進行了定量分析，并對其與海拔的相關(guān)性進行了探討，以期為粗莖秦艽規(guī)范化種植中基地選擇提供參考。

1 材料

1.1 材料與試劑Agilent 1200高效液相色譜儀，包括：G1322A在線脫氣機、G1311A四元梯度泵、G1329A進樣器、G1316A柱溫箱、G1314B VWD檢測器和ChemStation色譜工作站（美國Agilent公司）。Agilent Zorbax SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），GH-252電子天平（日本AND）、SB25-12D超聲波清洗機（功率500 W，頻率60 kHz，寧波新芝生物科技股份有限公司），AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。色譜級甲醇、乙腈（Fisher Scientific，F(xiàn)airlawn New Jersey），水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥對照品馬錢苷酸（批號：MUST-11042501）、獐牙菜苦苷（批號：MUST-11012401）、龍膽苦苷（批號：MUST-11011401）和獐牙菜苷（批號：MUST-11020802）均購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%。

1.3 實驗樣品粗莖秦艽為蘭坪恒通農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司野生撫育種植在山地上的4年生藥材，2016年1月23日至25日采于云南省蘭坪縣4個村。見表1。經(jīng)段寶忠副教授鑒定為粗莖秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.的干燥根，標本存放于大理大學藥學與化學學院標本館。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件、對照品溶液的制備及標準曲線和線性考察參見文獻〔5〕進行。

2.2 供試品溶液的制備取本品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加水15 mL，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定重量，補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1精密度試驗取同一供試品溶液（S5），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，12個共有峰峰面積的RSD＜0.97%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重復性試驗取同一樣品（S5）6份，按“2.2”項下方法制備，進樣測定。計算4個環(huán)烯醚萜苷類成分含量，其RSD＜1.26%，表明該實驗方法重復性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液（S5），分別在0，4，8，12，18，24，48 h進行測定，計算含量，RSD均＜1.36%，說明各對照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4加樣回收率實驗取已知含量的同一份粗莖秦艽藥材細粉，精密稱定6份，分別精密加入一定量的對照品，按“2.2”項下方法制備，進樣測定，計算回收率，平均回收率在99.77%～100.66%，RSD≤1.48%。

2.4 樣品含量測定取26批粗莖秦艽樣品，按“2.2”項下方法制備，平行操作3次，按外標法計算4種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量，HPLC圖譜見圖1，含量測定結(jié)果見表2。從表2中可看出，8～17號樣品（海拔2 707～2 750 m）中4種環(huán)烯醚萜苷類成分的總含量在92～117 mg∕g之間，其余海拔批次樣品總含量均低于90 mg∕g。

圖1 樣品（A）及對照品（B）HPLC圖譜

表2 不同海拔粗莖秦艽中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷的含量

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1指紋圖譜的建立及相似度評價將26批粗莖秦艽藥材HPLC圖譜導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2.0版）軟件，以S1批次藥材圖譜為參照譜進行指紋匹配，確定了12個共有峰，其中4個色譜峰通過對照品保留時間確認，分別為馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷。粗莖秦艽特征指紋圖譜的共有模式圖譜見圖2（R），26批樣品相似度結(jié)果見表3，結(jié)果顯示，樣品相似度均大于0.9，表明各批次樣品質(zhì)量均一。

圖2 26批粗莖秦艽樣品HPLC圖譜

表3 26批粗莖秦艽藥材的相似度

2.5.2主成分分析運用SPSS 17.0對26批藥材化學共指紋圖譜進行主成分分析，相關(guān)系數(shù)矩陣結(jié)果見表4。結(jié)果表明，獐芽菜苦苷與龍膽苦苷具有較大的正相關(guān)性；馬錢苷酸與獐芽菜苦苷、龍膽苦苷均有較大正相關(guān)性；4種化學成分與海拔無顯著相關(guān)性。將不同粗莖秦艽成分含量標準化數(shù)據(jù)與相應(yīng)主成分得分系數(shù)的乘積相加得到粗莖秦艽含量的主成分得分，得分圖見圖3。從圖3中可看出，11號樣品得分最高，9、13、14號樣品次之，其中8～17號樣品的得分均較高，其海拔范圍集中在2 700～2 750 m之間。主成分分析的得分情況反映了不同產(chǎn)地粗莖秦艽的藥材質(zhì)量，得分越高，表明粗莖秦艽的質(zhì)量越好。相對于其他海拔地區(qū)的樣品，2 700 m左右地區(qū)的粗莖秦艽藥材質(zhì)量較優(yōu)。

表4 相關(guān)性矩陣

圖3 26批粗莖秦艽樣品主成分分析得分圖

3 討論

本實驗采用HPLC法，建立了粗莖秦艽藥材HPLC圖譜及其共有模式圖譜，并對其有效成分馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量進行了測定。從結(jié)果可見，粗莖秦艽中4種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量變化存在差異，其中以龍膽苦苷的含量最高，馬錢苷酸次之，獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量均較低。26批藥材含量測定結(jié)果顯示均符合《中國藥典》質(zhì)量規(guī)定，指紋圖譜相似度均大于0.9，表明藥材質(zhì)量較均一。4種活性成分的總含量隨海拔升高呈鐘狀變化。海拔2 700 m左右地區(qū)的粗莖秦艽有效成分含量明顯高于其他區(qū)域，實驗結(jié)果對粗莖秦艽人工種植及仿野生栽培基地選擇提供了科學參考。云南西北部地區(qū)蘭坪縣、劍川縣、維西縣等地海拔2 700 m左右，有大面積的荒地、輪歇地，這些地區(qū)不適宜其他農(nóng)作物的生長，而恰是粗莖秦艽等中藥材的適生區(qū)域。在這些地區(qū)發(fā)展粗莖秦艽等中藥材的野生撫育種植，對促進當?shù)厣鐣?jīng)濟發(fā)展，推動山區(qū)群眾脫貧致富具有重要的現(xiàn)實意義。

〔1〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：270.

〔2〕曹曉燕，王喆之.云南粗莖秦艽不同采收期4種環(huán)烯醚萜苷類成分的測定〔J〕.藥物分析雜志，2010（4）：623-625.

〔3〕李金花，曾銳，李文濤，等.秦艽品質(zhì)與氣候因子相關(guān)性分析〔J〕.世界中醫(yī)藥，2016，11（5）：801-806.

〔4〕吳靳榮，趙志禮，王妍妍，等.云南麗江產(chǎn)粗莖秦艽栽培品種的品質(zhì)評價〔J〕.中成藥，2010，32（2）：250-252.

〔5〕段寶忠，黃林芳，尚飛能，等.云南野生撫育粗莖秦艽藥材的品質(zhì)評價〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2013，19（21）：82-86.

〔6〕宋九華，楊文鈺，孟杰，等.HPLC波長切換法同時測定粗莖秦艽中6個成分的含量〔J〕.化學研究與應(yīng)用，2014，26（7）：1136-1140.

〔7〕張曉燦，李楊，羅丹丹，等.基于指紋圖譜和化學計量學的多基原秦艽藥材化學品質(zhì)比較研究〔J〕.大理大學學報，2017，2（6）：37-40.

〔8〕宋九華，孟杰，曾羽，等.粗莖秦艽根莖品質(zhì)與栽培土壤化學因子的相關(guān)性分析〔J〕.植物資源與環(huán)境學報，2014，23（4）：75-82.

Effect of Different Altitudes on the Content of Iridoid Glycoside in Gentiana crassicaulis

Zhang Xiaocan,Duan Baozhong,Luo Dandan,Tao Aien,Li Yang*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To observe the content of iridoid glycoside inGentiana crassicaulsgrowing at different altitudes and to provide a scientific basis for the cultivation of this herb and its suitable planting areas.Methods：A HPLC method was used to measure the content of four active components inGentiana crassicaulsat different altitudes,and chemometric methods were applied to analyze HPLC fingerprinting and chemical recognition.Results：The content of the active components in this medical plant from 26 product batches was in compliance with relevant standards of quality.The similarity of chromatographic fingerprints was greater than 0.9.The experimental results indicated that the influence of altitude variations on the content of iridoid glycoside was not significant.Conclusion：The iridoid glycoside content in theGentiana crassicaulsroots at the altitude of 2 700 m is higher than that at other altitudes which is suitable for the cultivation ofGentiana crassicauls.

Gentiana crassicauls;altitudes;iridoid glycoside

R284.2

A

2096-2266（2017）08-0013-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.004

（責任編輯 李楊）

云南省中青年學術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才項目（2015HB058）；云南省基礎(chǔ)研究計劃資助項目（2016FD073）

2016-12-08

2017-03-21

張曉燦，碩士研究生，主要從事中藥資源與鑒定研究.

*通信作者：李楊，編輯.