李若玢，陳均源， 歐陽媛，高綠芬，王曉玉

荷人卵巢癌小鼠異種移植模型的建立及其生物學(xué)特性

李若玢，陳均源， 歐陽媛，高綠芬，王曉玉

卵巢腫瘤；Matrigel；NOD/SCID小鼠；裸鼠；動物模型

卵巢癌病死率位居?jì)D科三大惡性腫瘤之首，病理同型癌癥患者的基因?qū)用娌町悓?dǎo)致其對傳統(tǒng)放、化療敏感性各異[1]?；颊咴葱援惙N移植(patient-derived xenograft, PDX)小鼠模型中除了癌細(xì)胞以外，還包括人體免疫、纖維、脈管細(xì)胞等間質(zhì)成分，與傳統(tǒng)細(xì)胞株懸液構(gòu)建的小鼠模型相比，保留了原腫瘤部分免疫生長微環(huán)境，為卵巢癌耐藥機(jī)制研究、新藥開發(fā)及治療方案篩選提供了具有預(yù)測價值的個性化抗癌藥物療效檢測平臺[2]。然而目前PDX建模方法存在成瘤率低、周期長、成本高、難以擴(kuò)大規(guī)模等不足，本實(shí)驗(yàn)針對其不足進(jìn)行改進(jìn)，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 人卵巢癌原代及傳代異種移植模型建立 BALB c(nu-nu)雌性裸小鼠58只，NOD/SCID雌性小鼠6只，鼠齡4～8周，購自北京華阜康生物公司，合格證號：SCXK(京)2014-0004，飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心無特定病原體環(huán)境下。術(shù)中取患者新鮮卵巢癌組織(病理診斷為卵巢黏液性囊腺癌高分化型)置于4 ℃ RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，于凈化工作臺上去除微小血管及壞死組織，無菌生理鹽水反復(fù)沖洗后剪切成大小2 mm×2 mm×2 mm組織塊，冰浴下1 ∶1與Matrigel(美國BD公司)混合備用。小鼠常規(guī)消毒，取備用組織塊于套管針頭內(nèi)，組織鑷提起右背部表皮，于皮膚張力最大處穿刺進(jìn)入小鼠右腋下，推動實(shí)體針，植入皮下，標(biāo)本離體后須在1 h內(nèi)完成接種，此為原代荷人卵巢癌小鼠模型(下稱PDX1)，其中NOD/SCID小鼠6只(下稱PDX1-1)，裸小鼠8只(下稱PDX1-2)。待初種瘤體直徑達(dá)1 cm后，選擇表面血供好、無破潰，質(zhì)地稍硬荷瘤小鼠處死，取瘤體外圍發(fā)亮部分組織，按上述移植方法接種于25只裸小鼠，建立第2代荷人卵巢癌小鼠模型(下稱PDX2)。再次成瘤后重復(fù)上述步驟，建立第3代荷人卵巢癌小鼠模型(下稱PDX3)。

1.2 移植后動物及瘤體生長情況觀察 每日進(jìn)行小鼠全身狀況、活動情況觀察及瘤體測量，按公式V=(D×d2)/2計(jì)算瘤體體積(D為腫瘤表面最長徑，d為腫瘤表面最短徑)，繪制瘤體生長變化曲線。處死小鼠后肉眼觀察移植瘤的形態(tài)、質(zhì)地、活動度、播散范圍及轉(zhuǎn)移情況。瘤體組織固定于10%中性福爾馬林中，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用或百分率表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人卵巢癌移植瘤生長情況 各代卵巢癌小鼠成瘤率分別是PDX1-1 83%(5/6)、PDX1-2 0(0/8)、PDX2 100%(25/25)、PDX3 100%(25/25)。根據(jù)瘤體生長情況繪制生長變化曲線圖(圖1)，提示瘤體于5～6周左右進(jìn)入指數(shù)生長期，8周左右基本成瘤。原代NOD/SCID小鼠較裸小鼠成瘤率高，生長速度更快，并伴發(fā)頭面部、腹腔臟器轉(zhuǎn)移灶(圖2A)；傳代裸小鼠成瘤及生長速度更快，但均無轉(zhuǎn)移情況(圖2B)；以上瘤體直徑接近1.5 cm即出現(xiàn)表面破潰、壞死，直徑超過3 cm荷瘤鼠出現(xiàn)行動不便、食欲減退、消瘦等惡病質(zhì)表現(xiàn)。

圖1 實(shí)體瘤生長曲線

2.2 移植瘤大體形態(tài) 切除的瘤體外觀呈球形，質(zhì)稍硬，包膜多完整，表面可見血管紋理，剖開后呈乳白色，囊實(shí)性，部分瘤體內(nèi)含黏液，較大瘤體中央可見液化性壞死區(qū)(圖3)。

2.3 人卵巢癌及其各代模型瘤組織鏡檢 PDX1移植瘤鏡下可見腺腔樣結(jié)構(gòu)，腺體大小不一，形態(tài)不規(guī)則，間質(zhì)較少，上皮細(xì)胞明顯異型性，核仁明顯，病理性核分裂象易見，與人卵巢癌原有排列結(jié)構(gòu)及瘤細(xì)胞的異型性特征基本一致。隨著傳代次數(shù)增加，分化變低，腺樣結(jié)構(gòu)逐漸消失，上皮細(xì)胞分化差，核異型性明顯(圖4)。

②A②B③④A④B④C④D

圖2 荷卵巢癌小鼠：A.NOD/SCID小鼠；B.裸小鼠 圖3 實(shí)體瘤大體形態(tài) 圖4 人卵巢癌及其各代模型瘤組織HE染色：A.人卵巢癌；B.PDX1-1；C.PDX2；D.PDX3

3 討論

建立PDX模型首先要解決宿主抗人組織的免疫排斥問題，國外常用T、B、NK三系免疫細(xì)胞缺陷的NOD/SCID小鼠建模，成瘤率高，建模周期短，但成本昂貴[3]。國內(nèi)多采用T細(xì)胞功能缺陷的裸小鼠建模，雖然大大降低了成本，但成瘤率及瘤體生長速率明顯降低[4]。Mullen等[5]采用Matrigel與5種卵巢癌細(xì)胞株混合后移植到小鼠體內(nèi)，成瘤率可提高至90%以上。Matrigel是從EHS小鼠肉瘤中提取的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，富含各種促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化的生長因子及蛋白，4 ℃呈液態(tài)，與新鮮組織混合后注入小鼠皮下，于皮溫下逐漸凝固，包裹移植組織，形成一個各項(xiàng)因子濃度梯度分布穩(wěn)定，具有一定免疫隔離作用的腫瘤生長微環(huán)境[6]。

李艷等[7]選取64例上皮性卵巢癌組織于裸小鼠體內(nèi)接種，原代成瘤率分別為：漿液性腺癌52.5%、子宮內(nèi)膜樣腺癌62.5%、透明細(xì)胞腺癌71.43%、低分化腺癌60%、黏液性腺癌0，裸鼠間傳代成功率達(dá)94.12%。本實(shí)驗(yàn)接種組織為黏液性腺癌，接種結(jié)果表明，裸小鼠體內(nèi)難成瘤的人卵巢癌細(xì)胞，能夠在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤，且瘤體生長速度及轉(zhuǎn)移率均增高，深度免疫功能缺陷小鼠，能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供一個更為優(yōu)良的生長環(huán)境。同時，Matrigel能夠在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。原代移植瘤PDX1傳代于裸小鼠后，PDX2及PDX3成瘤率均接近100%，分析其可能原因?yàn)槿寺殉舶┙M織移植小鼠后，癌細(xì)胞進(jìn)入重新適應(yīng)小鼠組織內(nèi)環(huán)境的過程，其中分化較低、侵襲性較高的腫瘤細(xì)胞得以保留并繼續(xù)克隆，每次傳代相當(dāng)于一次篩選，惡性程度逐漸增高，同時部分間質(zhì)細(xì)胞被小鼠間質(zhì)細(xì)胞替代，異種免疫原性降低，腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境逐漸趨向穩(wěn)定，成瘤率也隨之增高。

Scott等[8]認(rèn)為，初發(fā)患者手術(shù)標(biāo)本建立的PDX模型能夠很好地模擬復(fù)發(fā)后卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并可先于臨床復(fù)發(fā)進(jìn)行治療方案篩選，為復(fù)發(fā)患者的有效治療搶得先機(jī)，然而目前PDX的建模時間需要至少4～8個月[9]。本實(shí)驗(yàn)對PDX建模方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合Matrigel的使用，根據(jù)NOD/SCID小鼠及裸小鼠的優(yōu)缺點(diǎn)，首先在NOD/SCID小鼠皮下建立數(shù)只原代種鼠模型，后采用裸小鼠進(jìn)行穩(wěn)定傳代迅速擴(kuò)大荷瘤小鼠規(guī)模，建立了一種成瘤率高、成本低、觀察周期較長、傳代穩(wěn)定易復(fù)制的小鼠荷瘤模型。不過，本實(shí)驗(yàn)也存在以下不足：(1)標(biāo)本來源于臨床手術(shù)患者，對于非手術(shù)患者無法建模，今后應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中嘗試采用臨床穿刺活檢組織或腹腔積液細(xì)胞進(jìn)行移植建模。(2)由于免疫缺陷鼠的使用，導(dǎo)致該模型無法預(yù)知免疫功能對腫瘤的殺傷作用，不適用于生物免疫治療相關(guān)研究。(3)瘤體僅傳至第3代，模型例數(shù)較少，同時缺乏人源腫瘤間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)檢測，不足以充分觀察傳代后移植瘤生長及微環(huán)境變化情況，還需進(jìn)一步深入完善。

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暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，廣州 510600

李若玢，女，碩士，醫(yī)師。E-mail: 373602649@qq.com 王曉玉，女，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，通訊作者。 E-mail: wxyjnu@icloud.com

時間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.024.html

R 737.31

B

1001-7399(2017)08-0925-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.024

接受日期：2017-04-20