陸 明，胡孔旺，王宜文，李 昊，曹立宇

叉頭框M1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

陸 明1，胡孔旺1，王宜文1，李 昊2，曹立宇2

目的 探討叉頭框M1(FOXM1)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。方法 采用免疫組化SP法檢測297例結(jié)直腸癌組織和80例對應(yīng)癌旁正常組織中FOXM1的表達(dá)；Western blot法檢測20例新鮮結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁組織中FOXM1的表達(dá)。結(jié)果 FOXM1在結(jié)直腸癌組織中的陽性率(70.97%)顯著高于癌旁組織(17.50%，P<0.01)；FOXM1表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤部位、大小、分化程度、CEA、CA199等無關(guān)(P>0.05)。結(jié)直腸癌組織中FOXM1蛋白相對表達(dá)量(0.855±0.063)明顯高于相應(yīng)癌旁組織(0.150±0.041，P<0.01)。FOXM1陽性患者的3年生存率明顯低于陰性患者(P<0.01)，且FOXM1為結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。結(jié)論 FOXM1蛋白在結(jié)直腸癌組織中過表達(dá)，且與患者臨床病理特征、預(yù)后等因素有關(guān)，可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用，有望成為結(jié)直腸癌新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

結(jié)直腸腫瘤；叉頭框M1；免疫組織化學(xué)；Western blot法；預(yù)后

結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，現(xiàn)階段我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均僅次于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌，位居惡性腫瘤的第5位，且逐年呈上升和年輕化趨勢[1]。目前結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)為主，術(shù)后輔予放、化療，但其療效一般，國內(nèi)患者確診后5年生存率仍低于50%，尤其對于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者缺乏有效的治療措施，其5年生存率不足10%；即使是病理同一級別的患者，予以同種手術(shù)及輔助放、化療等治療方案，患者預(yù)后也不同[2]。因此，尋找準(zhǔn)確的結(jié)直腸癌特異性標(biāo)志物進(jìn)行精準(zhǔn)靶向治療具有重要意義。FOXM1是FOX家族的重要成員之一，由一長約110個(gè)氨基酸的進(jìn)化上高度保守的DNA結(jié)合域構(gòu)成，稱為“叉頭框結(jié)構(gòu)”或“翼狀螺旋結(jié)構(gòu)”，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，特異性表達(dá)于增殖期細(xì)胞中，是一個(gè)典型的與細(xì)胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、DNA損傷修復(fù)、血管生成和細(xì)胞凋亡等過程中起重要作用[3-4]。FOX家族另一成員FOXO1也被證實(shí)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[5]。本文采用免疫組化和Western blot法檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXM1的表達(dá)，并隨訪患者的術(shù)后3年生存率，分析FOXM1表達(dá)與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年1月～2013年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療且資料完整的結(jié)直腸癌患者297例(表1)，術(shù)前患者均未行放、化療，且無其他合并癥；所選樣本年齡24～88歲，中位年齡61歲，男性176例，女性121例。按AJCC(2010)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期44例，Ⅱ期124例，Ⅲ期98例，Ⅳ期31例。另選取其中80例遠(yuǎn)離癌組織中心5 cm以上的結(jié)直腸癌旁組織作為對照。術(shù)后所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。隨訪自手術(shù)后開始，截止時(shí)間為2016年12月。另收集2016年11～12月間行手術(shù)治療且術(shù)前也未行放化療、無其他合并癥的結(jié)直腸癌患者的術(shù)后新鮮癌組織20例及相對應(yīng)的癌旁正常組織行Western blot檢測。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 運(yùn)用免疫組化SP法檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXM1的表達(dá)，主要操作步驟如下：用二甲苯和乙醇將組織石蠟切片脫蠟至水化；PBS清洗完全后加入EDTA稀釋液置入微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)；后滴加適量內(nèi)源性過氧化物酶封閉液封閉10 min；滴加一抗稀釋液(抗體濃度1 ∶150，購自Abcam公司)40～50 μL，4 ℃過夜；第2天，37 ℃復(fù)溫30 min后滴加適量二抗工作液(PV6000試劑盒，購自北京中杉金橋公司)，置37 ℃孵育18 min；清洗完畢后滴加DAB顯色工作液顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，染色完畢后迅速加入蒸餾水終止染色；蘇木精輕度復(fù)染，中性樹脂封固；由兩位副高以上病理科醫(yī)師雙盲閱片，獨(dú)立評分。

1.2.2 Western blot 各取適量組織加裂解液和PMSF勻質(zhì)裂解后反復(fù)離心取上清液提取蛋白；用BCA法行蛋白濃度檢測；后放入100 ℃水浴鍋中煮5 min使蛋白變性；配制10%SDA-PAG凝膠，每孔中加適量蛋白和Loading Buffer混合液，垂直電泳分離；電泳分離完全后將含F(xiàn)OXM1和內(nèi)參GAPDH的膠段切下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉60 min；加入20 mL FOXM1一抗稀釋液(抗體濃度1 ∶300，購自Abcam公司)和20 mL GAPDH一抗稀釋液(抗體濃度1 ∶3 000，購自北京中杉金橋公司)4 ℃過夜，次日洗膜完全后，加入二抗稀釋液(抗體濃度1 ∶3 000，購自博奧森公司)室溫孵育1 h；膜洗完全后，用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。

1.3 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果根據(jù)切片中陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)占所有腫瘤細(xì)胞的百分比和陽性腫瘤細(xì)胞的著色強(qiáng)度來判斷評分。(1)按陽性細(xì)胞數(shù)評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)﹤25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；(2)按著色強(qiáng)度評分：腫瘤細(xì)胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～3分為(-)，4～5分為(+)，6～7分為()，≥8分為()；(0～+)為陰性，(～)為陽性。Western blot結(jié)果用Image J行灰度分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值記為其相對表達(dá)量，以±s表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；生存分析和生存曲線使用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)分析；患者預(yù)后多因素相關(guān)分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXM1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) FOXM1在結(jié)直腸組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖1)，在結(jié)直腸癌組織中的陽性率(70.97%，198/279)高于癌旁正常組織(17.50%，14/80)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=61.903，P<0.001)。隨著腫瘤浸潤越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多、伴隨脈管內(nèi)癌栓轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚，F(xiàn)OXM1陽性率也相應(yīng)越高(P<0.05)；但與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、CEA、CA199等因素?zé)o關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 FOXM1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

*包括低分化、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌

2.2 Western blot法檢測結(jié)直腸癌及癌旁組織中FOXM1蛋白的表達(dá) 20例結(jié)直腸癌組織中FOXM1蛋白的平均相對表達(dá)量為0.855±0.063，癌旁正常組織的平均相對表達(dá)量為0.150±0.041，結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.886，P=0.005，圖2)。

ABCD

圖1 FOXM1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)：A.0；B.+；C.；D.，SP法

圖2 FOXM1蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.3 FOXM1表達(dá)與結(jié)直腸癌3年生存率的關(guān)系 所有患者的3年總體生存率為74.41%。FOXM1陽性者的3年生存率為65.15%；FOXM1陰性者的3年生存率為92.92%；FOXM1陽性者的生存率明顯低于陰性者(χ2=25.636，P<0.01)。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、CEA、CA199、FOXM1陽性等為影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2，圖3)。

圖3 FOXM1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者3年總生存率的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因參與的病理轉(zhuǎn)變過程，包括原癌基因(如K-RAS、c-myc、EGFR等)的激活和抑癌基因(如APC、DCC、p53等)的失活等[6]。因此從基因水平探索結(jié)直腸癌的生物學(xué)特性，尋找腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對結(jié)直腸癌的預(yù)防與治療具有重大的臨床意義。FOXM1是一種原癌基因，其功能大多是通過轉(zhuǎn)錄激活下游分子的表達(dá)來影響細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的，在靜止期或未分化細(xì)胞中表達(dá)較低，當(dāng)細(xì)胞被激活重新進(jìn)入細(xì)胞周期時(shí)表達(dá)增加[3]。研究表明FOXM1參與腫瘤發(fā)生的多種信號途徑如在G1/S期過程中誘導(dǎo)p21及p27等周期調(diào)節(jié)蛋白的降解，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行不斷的循環(huán)周期，使RAS-MEK-MAPK信號通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，從而明顯加強(qiáng)了癌細(xì)胞增殖能力[7]；另外FOXM1也可通過激活PI3K/Akt、EGFR、NF-κB、Notch等信號通路的作用促進(jìn)腫瘤的生成[8-11]。

FOXM1是人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)最頻繁的基因之一，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在子宮頸癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤組織中均存在高表達(dá)[12-15]，且與腫瘤分期和惡性侵襲性密切相關(guān)。同樣FOXM1可通過加速結(jié)直腸癌細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。如Li等[16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1表達(dá)與腫瘤浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、預(yù)后和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且FOXM1陽性患者更易引起血管、神經(jīng)的侵犯。Uddin等[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1在結(jié)直腸癌中的陽性率為66%，且與患者病理分化程度和反應(yīng)腫瘤增殖性標(biāo)志物如Ki-67和MMP-9密切相關(guān)，但與患者TNM分期及預(yù)后無明顯相關(guān)性。唐慧等[18]通過對結(jié)直腸癌癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織和正常結(jié)直腸組織進(jìn)行免疫組化分析

表2 結(jié)直腸癌患者總生存率的預(yù)后影響因素單因素和多因素分析

發(fā)現(xiàn)：FOXM1在正常結(jié)直腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤組織、結(jié)直腸癌組織中的陽性率分別為66.67%、94.00%、81.58%，三組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且推測FOXM1在結(jié)直腸腺瘤組織中異常高表達(dá)提示FOXM1基因可能參與結(jié)直腸腺瘤癌變過程，其過表達(dá)在結(jié)直腸腺瘤階段就已開始。

本組297例結(jié)直腸癌行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中，腫瘤浸潤深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管轉(zhuǎn)移等情況下，即腫瘤惡性程度越高FOXM1的陽性率亦越高，表明FOXM1可能具有促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等作用。另有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)OXM1能夠調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達(dá)，而MMP-2和MMP-9在降解細(xì)胞外基質(zhì)及基膜中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)[19]；另外FOXM1能與VEGF的啟動(dòng)子結(jié)合從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控VEGF的表達(dá)，參與腫瘤血管的生成，且VEGF在腫瘤的淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[20]；Park等[21]通過建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)FOXM1參與腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲及轉(zhuǎn)移前靶器官微環(huán)境的形成等。本組通過對結(jié)直腸癌患者的3年隨訪并對結(jié)果行生存分析得出FOXM1陽性者的預(yù)后明顯差于陰性者(P<0.01)，Cox多因素生存回歸分析得出FOXM1表達(dá)為結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因(P=0.005)，可能由于原癌基因FOXM1的陽性率越高，通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9和VEGF等因子的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過程，進(jìn)而使結(jié)直腸癌的惡性程度越高，從而影響此類患者的預(yù)后生存時(shí)間。在其他多種惡性腫瘤中FOXM1陽性者預(yù)后也同樣差于陰性者[22]，因此對FOXM1進(jìn)行術(shù)前檢測對在結(jié)直腸的診斷治療等過程具有重要的意義。

綜上所述，F(xiàn)OXM1過表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程中起重要作用，由此FOXM1可作為結(jié)直腸癌診斷和治療上的一種新分子標(biāo)志物，有望成為結(jié)直腸癌患者治療上新的靶向位點(diǎn)。

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Expression of FOXM1 in colorectal carcinoma and its clinical significance

LU Ming1, HU Kong-wang1, WANG Yi-wen1, LI Hao2, CAO Li-yu2

(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Purpose To investigate the expression of forkhead box M1 (FOXM1) in human colorectal cancer(CRC) tissues, and to analyze the correlation between its expression and clinicopathological parameters and prognosis of CRC. MethodsThe expression of FOXM1 was examined in 297 cases of CRC tissues and 80 cases of normal peritumoral tissues by immunohistochemistry of SP. Western blot was used to detect the expression of FOXM1 in 20 cases of fresh CRC tissues and the corresponding normal peritumoral tissues. Results The expression of FOXM1 was significantly higher in CRC tissues (60.6%) compared with normal peritumoral tissues ( 17.50%,P<0.01). The positive expression of FOXM1 was related to the depth of invasion, lymph node metastasis, intravascular cancer embolus, distant metastasis and TNM stage (P<0.05). However, there was no correlation with age, sex, tumor location, tumor size, tumor differentiation degree, CEA and CA199 (P>0.05). The relative expression levels of FOXM1 protein was also significantly higher in CRC tissues (0.855±0.063) compared with corresponding normal peritumoral tissues (0.150±0.041,P<0.01). The 3-year overall survival of CRC patients with FOXM1 expression was significantly lower than that of patients without FOXM1 expression (P<0.01), and FOXM1 is an independent prognostic factor for CRC. Conclusion The overexpression of FOXM1 protein in CRC tissues correlate with the clinicopathological characteristics and prognosis. FOXM1 may play an important role in the occurrence and metastasis of CRC, and it may be a new tumor marker and potential therapeutic target for CRC.

colorectal neoplasms; FOXM1; immunohistochemistry; Western blot; prognosis

安徽省省級質(zhì)量工程項(xiàng)目(2016jxtd061)、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015度新技術(shù)項(xiàng)目(2-22)、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014后備人才項(xiàng)(20148)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1胃腸外科、2病理科，合肥 230022

陸 明，男，碩士研究生。E-mail: pwluming@126.com 胡孔旺，男，博士，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: hukw@sina.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.005.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)08-0847-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.005

接受日期：2017-06-27