郭艷麗，鄺 鋼，周 珍，董稚明，郭 煒，沈素朋，梁 佳，郭 鑫

·論 著·

DAPPER1對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制

郭艷麗，鄺 鋼，周 珍，董稚明，郭 煒，沈素朋，梁 佳，郭 鑫

目的 檢測(cè)DAPPER1蛋白對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)細(xì)胞株惡性生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步分析ESCC組織中DAPPER1蛋白表達(dá)及引起其表達(dá)異常的可能機(jī)制。方法 應(yīng)用MTT、克隆形成、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DAPPER1對(duì)ESCC細(xì)胞株惡性生物學(xué)行為的影響；應(yīng)用RT-PCR及甲基化特異性PCR(methylation specific PCR, MSP)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞株(TE13、T.Tn、Eca109)中DAPPER1 mRNA的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)法檢測(cè)ESCC組織中DAPPER1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 DAPPER1在3株細(xì)胞中呈弱表達(dá)或陰性，應(yīng)用甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-Dc)處理細(xì)胞后，其表達(dá)強(qiáng)度在各細(xì)胞株中均有不同程度的增加；同時(shí)，DAPPER1過表達(dá)及5-Aza-Dc處理可明顯抑制TE13細(xì)胞的增殖及遷移能力；而應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿﹖richostatin A(TSA)處理細(xì)胞株后，DAPPER1在各細(xì)胞株中的表達(dá)無明顯改變；DAPPER1蛋白在ESCC組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯下調(diào)(P<0.01)，且其表達(dá)與該基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化狀態(tài)有關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 ESCC中DAPPER1主要起抑癌基因作用，并且該基因啟動(dòng)子區(qū)域的異常高甲基化可能是引起其表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制之一。

食管腫瘤；甲基化；增殖；遷移；DAPPER1

Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞的增殖、分化等多種生命過程，研究表明該通路的異?；罨c多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，包括食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)[1]。因此，有關(guān)該通路關(guān)鍵因子功能的研究對(duì)于明確ESCC的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。研究指出DAPPER1在多種腫瘤中的表達(dá)水平低于正常對(duì)照組織并具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力，被認(rèn)為是Wnt通路的抑制因子之一[2]。但其在ESCC中的作用及其表達(dá)情況仍未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過分析DAPPER1蛋白對(duì)ESCC細(xì)胞株惡性生物學(xué)行為的影響及ESCC組織中DAPPER1的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)，探討DAPPER1在ESCC中的可能作用及引起其表達(dá)調(diào)控異常的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2005年～2009年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科診治的ESCC患者159例。其中男性93例，女性66例，平均年齡57.9歲(36～79歲)?；颊咝g(shù)前均未行放、化療。每例患者均取癌組織原發(fā)灶及距癌組織2～5 cm處的癌旁組織，手術(shù)切除標(biāo)本一部分保存在-80 ℃低溫冰箱用于提取DNA及RNA，另一部分進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)HE染色，經(jīng)病理醫(yī)師診斷證實(shí)癌組織均為ESCC，癌旁組織均為正常黏膜組織或增生的黏膜組織。腫瘤患者臨床分期根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)及國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control, UICC)標(biāo)準(zhǔn)；腫瘤病理分級(jí)根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)；上消化道腫瘤(upper gastrointestinal cancers, UGIC)家族史陽(yáng)性定義為家族中有一名以上一級(jí)親屬和(或)兩名以上二級(jí)親屬患食管癌/賁門癌/胃癌者。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 實(shí)驗(yàn)用的5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-Dc)、曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)、噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(Epitect Fast Bisulfite Conversion Kits)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；甲基轉(zhuǎn)移酶(M.SssI)購(gòu)自北京美科美生物公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcription System A3500)購(gòu)自Promega北京生物公司；本實(shí)驗(yàn)所用全部引物均由北京賽百勝基因公司合成。兔抗人多克隆抗體DAPPER1(1 μg/mL，ab72078)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ECL發(fā)光試劑購(gòu)自碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 常規(guī)培養(yǎng)TE13、T.Tn、Eca109細(xì)胞株，待細(xì)胞密度較低且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別用5 μmol/L的5-Aza-Dc處理72 h或0.3 μmol/L TSA處理24 h，期間每24 h更換1次培養(yǎng)液，處理完畢后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞，提取DNA及RNA，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。藥物劑量及處理時(shí)間依據(jù)先前文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]。未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3.2 建立DAPPER1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 將含人全長(zhǎng)DAPPER1基因的pcDNA3.1質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至低表達(dá)DAPPER1的人ESCC細(xì)胞株TE13中，經(jīng)G418抗性篩選，得到過表達(dá)DAPPER1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株DAPPER1/TE13及對(duì)照組細(xì)胞株pcDNA3.1/TE13。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DAPPER1/TE13及pcDNA3.1/TE13細(xì)胞以及5-Aza-Dc處理72 h后TE13細(xì)胞分別消化并接種于96孔板，測(cè)定各孔吸光度值，檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。

1.3.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞貼壁克隆生長(zhǎng)的能力 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TE13細(xì)胞、DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc處理72 h后TE13細(xì)胞，將細(xì)胞消化吹打?yàn)閱渭?xì)胞混懸液，接種于35 mm培養(yǎng)皿(500個(gè)細(xì)胞/皿)。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待有克隆長(zhǎng)出，蘇木精染色，鏡下觀察，并計(jì)算各組細(xì)胞的克隆形成率。

1.3.5 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組TE13細(xì)胞及一組過表達(dá)DAPPER1的DAPPER1/TE13細(xì)胞分別消化并接種于24孔板，其中一組TE13細(xì)胞株用5-Aza-Dc處理72 h，分別用10 μL移液器吸頭垂直于孔底劃一條直線，鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)劃痕愈合情況。初始劃痕寬度定義為1。

1.3.6 甲基化特異性PCR(methylation specific PCR, MSP)技術(shù)檢測(cè)DAPPER1基因的甲基化狀態(tài) 采用酚/氯仿抽提法，提取細(xì)胞株及組織標(biāo)本中的DNA，分光光度計(jì)進(jìn)行定量后，取適量DNA按照亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒說明書將DNA變性及純化。MSP引物序列：上游 5′-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3′，下游 5′-AAACGCTAAAACTACGACCGCG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度121 bp。用經(jīng)甲基化酶(Sss I)處理后的基因組DNA作為甲基化的陽(yáng)性對(duì)照，用無消化系統(tǒng)腫瘤及其它系統(tǒng)腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化的陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照則用滅菌雙蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR。另隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。

1.3.7 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)DAPPER1基因mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑說明書提取細(xì)胞株中總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用于檢測(cè)DAPPER1基因mRNA的表達(dá)。引物序列：上游5′-CACAAGCGAACTGACTACCG-3′，下游5′-GTAATTGCTCTGCTCGTCCT-3′，片段大小237 bp。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH作為內(nèi)參照。利用圖像分析系統(tǒng)Gel work-2ID對(duì)mRNA進(jìn)行定量。

1.3.8 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)法檢測(cè)DAPPER1蛋白的表達(dá) 應(yīng)用常規(guī)SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用EDTA高壓修復(fù)2 min，血清封閉，一抗孵育過夜，再依次加入二抗和三抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗做空白對(duì)照。陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)。以傳統(tǒng)的染色強(qiáng)度與著色面積雙評(píng)分的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[6]。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)的高倍視野(×400)，根據(jù)染色深淺和著色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。(1)按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無陽(yáng)性染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按著色百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，≥75%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～2分為陰性，3～6分為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 ESCC細(xì)胞株中啟動(dòng)子區(qū)甲基化及組蛋白乙?；瘜?duì)DAPPER1基因表達(dá)的影響 為明確表觀遺傳學(xué)的兩大機(jī)制(甲基化及組蛋白乙?；?是否對(duì)DAPPER1基因的表達(dá)有影響，此次實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用5-Aza-Dc及TSA處理細(xì)胞株。結(jié)果顯示，DAPPER1基因在3株細(xì)胞株中均呈弱陽(yáng)性或陰性，應(yīng)用5-Aza-Dc處理后，其mRNA表達(dá)增強(qiáng)或恢復(fù)為陽(yáng)性；而應(yīng)用TSA處理細(xì)胞后，DAPPER1基因在3株細(xì)胞株中的表達(dá)無明顯變化。同時(shí)，MSP結(jié)果顯示，5-Aza-Dc處理前，3株細(xì)胞株均可檢測(cè)出較強(qiáng)的甲基化條帶，處理后，甲基化條帶減弱或消失，而非甲基化條帶出現(xiàn)或增強(qiáng)(圖1)。

圖1 5-Aza-Dc及TSA處理對(duì)DAPPER1 mRNA表達(dá)及 基因甲基化狀態(tài)的影響

M.甲基化基因；U.非甲基化基因；GAPDH為內(nèi)參基因

2.2 DAPPER1基因?qū)SCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

2.2.1 DAPPER1過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對(duì)TE13細(xì)胞增殖能力的影響 利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DAPPER1基因過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對(duì)TE13細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，TE13、pcDNA3.1/TE13、DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc處理細(xì)胞株其增殖指數(shù)分別為0.894±0.016、0.886±0.019、0.394±0.029、0.480±0.028，與未經(jīng)處理的TE13細(xì)胞株及轉(zhuǎn)入空載體的pcDNA3.1/TE13相比，DAPPER1基因過表達(dá)細(xì)胞株及5-Aza-Dc處理可使細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯下降(P<0.01，圖2)。

圖2 MTT法檢測(cè)DAPPER1基因?qū)E13細(xì)胞增殖能力的影響**P<0.01，##P<0.01

2.2.2 DAPPER1過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對(duì)TE13細(xì)胞貼壁克隆生長(zhǎng)的變化 應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DAPPER1過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對(duì)TE13細(xì)胞貼壁克隆生長(zhǎng)的變化。結(jié)果顯示：過表達(dá)DAPPER1及5-Aza-Dc處理后的TE13細(xì)胞均較野生型TE13細(xì)胞克隆形成能力減弱[(29.600±6.974)%vs(61.867±10.086)%；(15.867±3.443)%vs(61.867±10.086)%]，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t過表達(dá)=16.288，P=0.004；t處理=11.218，P=0.008；圖3)。

圖3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DAPPER1對(duì)TE13細(xì)胞 貼壁生長(zhǎng)能力的影響 **P<0.01

2.2.3 DAPPER1過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對(duì)TE13細(xì)胞遷移能力的影響 應(yīng)用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DAPPER1基因過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對(duì)TE13細(xì)胞遷移能力的影響。過表達(dá)DAPPER1的DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc處理后的TE13細(xì)胞在12 h、24 h、36 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)的劃痕相對(duì)寬度值見表1，DAPPER1過表達(dá)以及5-Aza-Dc處理使TE13細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的遷移率均低于未經(jīng)處理的TE13，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 過表達(dá)DAPPER1及5-Aza-Dc處理后的TE13 細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)劃痕寬度±s，n=3)

#P<0.05；*P<0.05

2.3 ESCC組織中DAPPER1蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 ESCC組織中DAPPER1蛋白陽(yáng)性率為59.1%(94/159)，明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁非腫瘤組織(79.2%，126/159)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.104，P<0.001)。DAPPER1蛋白陽(yáng)性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期患者中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05)，而該蛋白表達(dá)與ESCC患者年齡、性別、腫瘤組織的病理分級(jí)及上消化道腫瘤家族史均無關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌中DAPPER1蛋白表達(dá)與 臨床病理特征的關(guān)系

2.4 ESCC組織中DAPPER1蛋白表達(dá)與該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的關(guān)系 在94例DAPPER1蛋白陽(yáng)性的ESCC組織中，基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化現(xiàn)象者23例，甲基化頻率(24.5%)明顯低于DAPPER1蛋白陰性的ESCC組織；ESCC組織中DAPPER1蛋白表達(dá)與其甲基化狀態(tài)有關(guān)(表3)。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌中DAPPER1蛋白表達(dá)與其 基因甲基化狀態(tài)的關(guān)系

M.甲基化；U.非甲基化

3 討論

DAPPER家族是在以爪蟾為模型研究神經(jīng)管的分化時(shí)，運(yùn)用酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)的可與Dishevelled相互作用的抑制因子[7]。DAPPER1是該家族的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)DAPPER1與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，尤其是Wnt通路的關(guān)系極為密切，并可通過對(duì)信號(hào)分子的調(diào)控參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-10]。

DAPPER1基因定位于人類染色體14q23.1區(qū)域，在多種惡性腫瘤中均報(bào)道有該區(qū)域的缺失或斷裂，因此認(rèn)為在染色體的該區(qū)域可能存在腫瘤抑制基因[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌[12]、胃癌[8]、肺癌[13]等多種惡性腫瘤中DAPPER1的表達(dá)低于正常組織，提示其抑癌基因的作用，并且在對(duì)肺癌[13]的研究中發(fā)現(xiàn)DAPPER1低表達(dá)者預(yù)后較差。同時(shí)研究指出DNA啟動(dòng)子甲基化可能是導(dǎo)致DAPPER1表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一[14]。但有關(guān)DAPPER1在ESCC中的表達(dá)及其發(fā)揮的生物學(xué)功能仍未見報(bào)道。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中DAPPER1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)癌旁非腫瘤組織，與先前的研究報(bào)道一致。提示DAPPER1蛋白在ESCC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。

為進(jìn)一步明確DAPPER1在ESCC中發(fā)揮的作用及引起其表達(dá)異常的可能機(jī)制。研究者首先檢測(cè)了3株ESCC細(xì)胞株中DAPPER1基因mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)均為陰性或弱表達(dá)。應(yīng)用5-Aza-Dc進(jìn)行處理，該藥物可通過降低DNA甲基化酶的活性而重新開啟因高甲基化而沉默的基因。結(jié)果顯示處理后3株ESCC細(xì)胞系DAPPER1表達(dá)均明顯升高；同時(shí)MSP結(jié)果顯示，5-Aza-Dc處理后該基因的甲基化條帶減弱或消失，而非甲基化條帶則明顯增強(qiáng)；兩結(jié)果共同提示ESCC中DAPPER1基因的高甲基化水平可能是引起其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制之一。對(duì)ESCC組織標(biāo)本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中DAPPER1基因的高甲基化現(xiàn)象明顯高于癌旁非腫瘤組織，且與DAPPER1蛋白表達(dá)缺失相關(guān)，進(jìn)一步提示在ESCC組織標(biāo)本中DAPPER1基因存在甲基化失活現(xiàn)象。組蛋白乙酞化是表觀遺傳修飾的另一主要方面。組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可通過抑制組蛋白的去乙?；{(diào)節(jié)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TSA處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DAPPER1表達(dá)在處理前后無明顯改變，初步判定組蛋白的乙?；瘜?duì)該基因的表達(dá)無明顯影響。同時(shí)，本組實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT、克隆形成以及劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了DAPPER1對(duì)TE13惡性生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，5-Aza-Dc處理及DAPPER1過表達(dá)可明顯抑制TE13細(xì)胞的增殖及遷移能力。Yin等[9]在對(duì)乳腺癌的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)該基因在體內(nèi)及體外可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞的增殖，并可通過拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制細(xì)胞的遷移，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。在對(duì)肺癌[13]的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)抑制DAPPER1表達(dá)可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述，DAPPER1可抑制ESCC細(xì)胞的增殖及遷移能力，并在ESCC組織標(biāo)本中的表達(dá)量明顯低于癌旁非腫瘤組織，提示了其在ESCC中的抑癌基因作用；并且基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可能是引起其表達(dá)下調(diào)的主要表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一。

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Effect of DAPPER1 on malignant biological behavior ofesophageal carcinoma cells and its epigenetic regulatory mechanism

GUO Yan-li, KUANG Gang, ZHOU Zhen, DONG Zhi-ming , GUO Wei, SHEN Su-peng, LIANG Jia, GUO Xin

(DepartmentofPathology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,HebeiCancerInstitute,Shijiazhuang050011,China)

Purpose To investigate the effect of DAPPER1 on the malignant biological behavior in esophageal carcinoma cells, and further to analyze the expression and the possible regulated mechanism of DAPPER1 in esophageal squamous cell cancer (ESCC) samples. Methods MTT assay, colony formation assay and wound healing were used to examine the effect of DAPPER1 on malignant biological behavior in esophageal carcinoma cells, RT-PCR and MSP methods were applied respectively to examine the expression and the methylation status of DAPPER1 in three ESCC cell lines (TE13, T.Tn, Eca109). Immunohistochemistry was used to examine the DAPPER1 protein expression. Results The negative or weak expression of DAPPER1 was detected in ESCC cell lines. After treated with 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC, a demethylation agent), the expression level of DAPPER1 was obviously increased. Meanwhile, over expression of DAPPER1 or treated with 5-Aza-Dc could obviously inhibit proliferation and immigration abilities of TE13 cell line. The level of DAPPER1 expression had no obviously change after treated with trichostatin A (TSA). Decreased protein expression of DAPPER1 was observed in ESCC tumor tissues compared with non-cancerous tissues (P<0.01), and associated with the methylation status of this gene (P<0.01). Conclusion DAPPER1 plays an important role of tumor suppressor gene in esophageal carcinoma, and the aberrant hypermethylation may be one of the main mechanisms in abnormal expression of this gene.

esophageal neoplasms; methylation; proliferation; immigration; DAPPER1

國(guó)家自然科學(xué)基金(81472335)、河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20170698)

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，石家莊 050011

郭艷麗，女，博士，副主任醫(yī)師。E-mail: yanli800224@163.com 郭 煒，女，博士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: guowei7303@163.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.001.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)08-0827-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.001

接受日期：2017-05-16