鄧舜天 李 航 楊玉仙 王曉磊

(重慶市中醫(yī)院，重慶 400011)

腎損傷分子-1對(duì)急性腎損傷患者早期診斷的作用及臨床意義

鄧舜天 李 航 楊玉仙 王曉磊

(重慶市中醫(yī)院，重慶 400011)

目的探討腎損傷分子(Kim)-1對(duì)急性腎損傷患者早期診斷的作用及臨床意義。方法62例急性腎損傷患者根據(jù)病情程度分為輕度組與中重度組各31例，另選取同期31例體檢健康者為對(duì)照組。以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法對(duì)各組尿液Kim-1進(jìn)行檢測(cè)，以比色法對(duì)各組尿液NAG酶進(jìn)行檢測(cè)，以黃嘌呤氧化酶法對(duì)各組血清超氧化物歧化酶(SOD)進(jìn)行檢測(cè)，以六代巴比妥酸比色法對(duì)各組血清丙二醛(MDA)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)比各組尿Kim-1、尿NAG、血清SOD及MDA水平，分析尿Kim-1與尿NAG、血清SOD及MDA的相關(guān)性。結(jié)果輕度組與中重度組尿Kim-1、尿NAG酶、血清SOD及MDA水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，輕度組與中重度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；尿Kim-1與尿NAG酶、血清SOD、血清MDA呈正相關(guān)(r=0.723,0.503,0.544,均P<0.05)。結(jié)論尿Kim-1是急性腎損傷發(fā)病時(shí)較早出現(xiàn)的一項(xiàng)指標(biāo)，與尿NAG酶相比具有較高敏感性，可將其作為早期診斷急性腎損傷的內(nèi)源性標(biāo)志物。

腎損傷分子-1；急性腎損傷；早期診斷

急性腎損傷發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)〔1〕。其屬可逆性疾病，早期診斷及積極治療可有效避免該病進(jìn)展為腎實(shí)質(zhì)性腎衰竭。傳統(tǒng)多采用尿素氮、血肌酐等指標(biāo)對(duì)急性腎損傷進(jìn)行早期診斷，但其敏感性及特異性較低，易造成漏診或誤診，延誤患者最佳治療時(shí)機(jī)〔2〕。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腎損傷分子(Kim)-1是急性腎損傷標(biāo)志物，Kim-1是一種新型新I型跨膜糖蛋白，在正常腎組織中幾乎不表達(dá)〔3〕。有國(guó)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Kim-1在腎毒性或缺血等因素引發(fā)的急性腎損傷患者腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平異常增高，其細(xì)胞外域經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶作用能分解為可溶性片段并釋放到細(xì)胞外，隨后排入尿中〔4〕。本文旨在探討Kim-1對(duì)急性腎損傷患者早期診斷的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 抽取2014年2月至2015年12月重慶市中醫(yī)院接收的62例急性腎損傷患者，根據(jù)病情程度分為輕度組與中重度組各31例，另選取同期31例體檢健康者為對(duì)照組。輕度組男16例，女15例；年齡18～68歲，平均(48.63±6.11)歲。中重度組男18例，女13例；年齡18～69歲，平均(48.59±6.06)歲。對(duì)照組男17例，女14例；年齡17～69歲，平均(48.57±6.10)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：無基礎(chǔ)腎臟疾病；知曉本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肺、心等重要臟器功能障礙或衰竭者；合并其他惡性腫瘤疾病者；具有認(rèn)知障礙或其他精神疾病，可能無法順利配合完成本研究者。3組年齡、性別等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2方法 研究對(duì)象均于入院后采集空腹?fàn)顟B(tài)下3.0～4.0 ml外周靜脈血及10.0 ml尿液，2 000 r/min離心10.0 min，取上清液，于-20℃條件下儲(chǔ)存待檢。

1.2.1尿液Kim-1檢測(cè) 以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法對(duì)尿液Kim-1進(jìn)行檢測(cè)：①取出待測(cè)標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)品，用樣品稀釋液對(duì)其進(jìn)行稀釋，使其濃度達(dá)50.0 ng/ml，隨后進(jìn)行系列倍比稀釋，使其濃度分別為0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、50.0 ng/ml；②分別設(shè)待測(cè)樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔，于空白孔中加入100 μl樣品稀釋液，其余各孔分別加入100 μl待測(cè)樣品及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，把樣品加于酶標(biāo)板底部，混合搖勻后于酶標(biāo)板上覆膜并放進(jìn)37℃水浴箱內(nèi)；③取出檢測(cè)溶液A，經(jīng)檢測(cè)稀釋液A1∶100對(duì)其進(jìn)行稀釋，隨后倒去液體并甩干，在各孔內(nèi)加入100 μl檢測(cè)溶液A工作液，覆膜后放入37℃水浴箱60 min；④取出濃洗滌液，利用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行稀釋，儲(chǔ)存?zhèn)溆?；⑤取出檢測(cè)溶液B，利用檢測(cè)稀釋液B1∶100對(duì)其進(jìn)行稀釋，混合均勻后進(jìn)行60 min溫育，倒出孔內(nèi)液體，甩干并洗板3次；⑥在各孔內(nèi)加入100 μl檢測(cè)溶液B工作液，覆膜后放入37℃水浴箱60 min，隨后倒出孔內(nèi)液體，甩干并洗板5次；⑦依次在各孔中加入90 μl底物溶液，于37℃水浴箱中行避光顯色處理，經(jīng)肉眼觀察可見標(biāo)準(zhǔn)品前3～4孔出現(xiàn)明顯梯度藍(lán)色且后3～4孔梯度不明顯時(shí)則立即終止操作。

1.2.2尿液NAG酶檢測(cè) 以比色法對(duì)尿液NAG酶進(jìn)行檢測(cè)：①取出待測(cè)標(biāo)本，于室溫下行解凍處理；②取出底物，通過底物緩沖液35 ml對(duì)其進(jìn)行溶解；③將濃終止液取出，利用蒸餾水對(duì)其行5倍稀釋處理；④取出標(biāo)準(zhǔn)品，通過450 μl蒸餾水對(duì)其行溶解處理；⑤將溶液混勻后置于紫外分光光度儀上，405 nm波長(zhǎng)處以蒸餾水調(diào)零，讀取各管A值；⑥計(jì)算尿液NAG酶活性(U/L)：(A測(cè)定-A測(cè)定空白)/(A標(biāo)準(zhǔn)-A標(biāo)準(zhǔn)空白)×標(biāo)準(zhǔn)品活性。

1.2.3血清超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè) 以黃嘌呤氧化酶法對(duì)血清SOD進(jìn)行檢測(cè)：①取出待測(cè)標(biāo)本于室溫下行解凍；②取出試劑一，分別加入蒸餾水將其稀釋至100 ml；③取出試劑四和4號(hào)稀釋液，以1∶4比例對(duì)其進(jìn)行稀釋；④取出試劑五，以75 ml、70℃～80℃雙蒸水對(duì)其進(jìn)行稀釋后于避光條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?；⑤取出試劑六，通過蒸餾水75 ml對(duì)其進(jìn)行溶解；⑥以3∶3∶2體積比將試劑五、六及冰乙酸配置成顯色劑，于避光條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?；⑦將溶液混勻后于室溫條件下放置10 min，在波長(zhǎng)550 nm處用1 cm光徑比色杯和蒸餾水調(diào)零，行比色處理。

1.2.4血清丙二醛(MDA)檢測(cè) 以六代巴比妥酸比色法對(duì)血清MDA進(jìn)行檢測(cè)：①取出待測(cè)標(biāo)本于室溫下行解凍；②取出試劑一，對(duì)其行適當(dāng)水浴加溫后使其呈透明狀；取出試劑二，加入340 ml蒸餾水后混合均勻儲(chǔ)存?zhèn)溆?；取出試劑三，放?0 ml 90℃熱雙蒸水內(nèi)，完全溶解后加入60 ml冰乙酸，混合均勻后于避免環(huán)境內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆?；③通過漩渦混勻器將溶液混合均勻，利用保鮮薄膜扎緊試管口，以針頭將其刺小孔后進(jìn)行95℃水浴(40 min)，隨后取出并冷卻，3 500 r/min離心10 min取上清液，于波長(zhǎng)532 nm處用1 cm光徑和蒸餾水調(diào)零后測(cè)定各管吸光度值。

1.3觀察指標(biāo) 對(duì)比各組尿Kim-1、尿NAG酶、血清SOD及MDA水平，分析尿Kim-1與尿NAG、血清SOD及MDA的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)及多元線性回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1各組尿Kim-1、尿NAG酶、血清SOD及MDA水平對(duì)比 輕度組與中重度組尿Kim-1、尿NAG酶、血清SOD及MDA均顯著高于對(duì)照組，且輕度組與中重度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

2.2急性腎損傷患者尿Kim-1與尿NAG酶、血清SOD、MDA相關(guān)性分析 尿Kim-1與尿NAG酶、血清SOD、MDA均呈正相關(guān)(r=0.723，0.503，0.544；均P<0.05)。

表1 各組尿Kim-1、尿NAG酶、血清SOD及MDA水平比較(±s,n=31)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與中重度組比較：2)P<0.05

3 討 論

急性腎損傷是一種因多類病因引發(fā)的復(fù)雜性腎功能紊亂疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，包括無尿性腎功能衰竭、血肌酐水平略微增高等，該病發(fā)病率在重癥監(jiān)護(hù)病房患者中可達(dá)16.8%左右，對(duì)患者預(yù)后及身體健康造成嚴(yán)重威脅〔5〕。雖然危重癥救治水平及腎臟替代治療技術(shù)不斷發(fā)展完善，但急性腎損傷患者整體病死率仍高達(dá)26.8%～44.6%，而重癥監(jiān)護(hù)病房急性腎損傷患者死亡率更是高達(dá)52.3%～82.6%〔6〕。另有流行病學(xué)研究指出，急性腎損傷逐漸趨向于老年化，隨著人口老齡化形勢(shì)加劇，其發(fā)病率持續(xù)增高〔7〕，而從病因?qū)W角度分析，腎前性急性腎損傷仍是引發(fā)該病的主要原因之一。

急性腎損傷是多種機(jī)制共同參與的極為復(fù)雜的生理病理過程，臨床醫(yī)學(xué)將其分為腎后性、腎實(shí)質(zhì)性及腎前性等多種類型，已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該病發(fā)病機(jī)制與代謝異常、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及炎癥反應(yīng)等多種因素密切相關(guān)〔8〕。此外，急性腎損傷發(fā)病時(shí)，患者腎小管上皮細(xì)胞在中毒、缺血等多原因協(xié)同作用下，導(dǎo)致氧自由基生成量增多〔9〕，而活性氧可通過以下方式損傷腎臟組織細(xì)胞：(1)使不飽和脂肪酸經(jīng)過氧化反應(yīng)對(duì)膜結(jié)構(gòu)造成直接干擾。在正常機(jī)體中，氧自由基生成量較少且壽命較短，內(nèi)源性氧自由基清除劑可將多余氧自由基進(jìn)行有效清除，因此不會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷〔10〕；(2)自由基可和膜上的受體、酶及膜的組成成分發(fā)生共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而對(duì)膜成分的活性、膜結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響。MDA是氧自由基和生物膜不飽和脂肪酸出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而出現(xiàn)的產(chǎn)物，其表達(dá)水平的變化與組織中氧自由基含量具有密切聯(lián)系，通過檢測(cè)MDA水平可對(duì)腎組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱以及氧自由基水平進(jìn)行有效評(píng)價(jià)〔11〕；SOD屬金屬蛋白酶物質(zhì)，可有效清除機(jī)體中氧自由基，從而避免生物體遭受自由基攻擊與損害，SOD活力可對(duì)機(jī)體清除氧自由基能力進(jìn)行間接反映〔12〕。因此，血清中MDA和SOD水平對(duì)檢測(cè)腎組織氧化應(yīng)激具有重要價(jià)值。

急性腎損傷常為可逆性，早期診斷并積極治療可有效避免其進(jìn)展為實(shí)質(zhì)性腎衰竭，但由于該病初期癥狀不明顯，因此臨床診斷中極易出現(xiàn)漏診或誤診，導(dǎo)致患者錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)〔13〕。Kim-1是一種新I型跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、黏蛋白結(jié)構(gòu)域、特征性Ig結(jié)構(gòu)域等。Kim-1在正常機(jī)體內(nèi)表達(dá)量極低，但腎組織遭受損傷后該物質(zhì)表達(dá)水平顯著增高且與腎損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)，在腎間質(zhì)纖維化、腎小管上皮細(xì)胞初期損傷及修復(fù)中具有重要作用，其具有信號(hào)傳導(dǎo)、黏附及參與免疫反應(yīng)等功能。Kim-1細(xì)胞外域經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶作用可于跨膜區(qū)附近分解成可溶性片段并釋放到細(xì)胞外隨后排入尿液，因此可在尿液中檢測(cè)出Kim-1可溶性片段，有研究證實(shí)，Kim-1在缺血性急性腎小管壞死患者尿液中表達(dá)水平異常增高，是因其他因素導(dǎo)致的急性腎小管壞死疾病的4倍左右，其次是因造影劑導(dǎo)致的急性腎小管壞死〔14〕。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果〔15〕基本一致。此外，Kim-1表達(dá)水平與雙腎尿蛋白、尿量及血壓等具有一定聯(lián)系；而且尿Kim-1表達(dá)水平的增高與急性腎損傷發(fā)病時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)存在一定關(guān)系。本研究結(jié)果提示尿Kim-1是急性腎損傷發(fā)病時(shí)較早出現(xiàn)的一項(xiàng)指標(biāo)，與尿NAG酶相比具有較高敏感性，可將其作為早期診斷急性腎損傷的內(nèi)源性標(biāo)志物。

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〔2016-06-15修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

鄧舜天(1977-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腎病研究。

R692.9

A

1005-9202(2017)16-4077-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.077