徐亞娟 金志巍 劉莉莉 劉文書(shū)

(吉林省腫瘤醫(yī)院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長(zhǎng)春 130012)

人參皂苷Rh2誘導(dǎo)口腔鱗癌耐藥細(xì)胞凋亡

徐亞娟 金志巍 劉莉莉 劉文書(shū)1

(吉林省腫瘤醫(yī)院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長(zhǎng)春 130012)

目的探討人參皂苷Rh2對(duì)口腔鱗癌耐藥細(xì)胞(KBV)的促凋亡作用及其對(duì)時(shí)間和劑量的時(shí)效量效關(guān)系。方法采用MTT法檢測(cè)人參皂苷Rh2于不同時(shí)間和濃度下對(duì)KBV的生長(zhǎng)抑制作用及藥物毒性實(shí)驗(yàn)；通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)一步檢測(cè)Rh2不同濃度和時(shí)間下誘導(dǎo)KBV的死亡率；利用提取Rh2作用后DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察KBV細(xì)胞基因組降解情況。結(jié)果48 h內(nèi)，KBV細(xì)胞在0～100 μg/ml的Rh2誘導(dǎo)下，其所導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制率隨著時(shí)量和劑量的增加而有所加強(qiáng)，對(duì)正常細(xì)胞的抑制率均在10%以下并且臺(tái)盼藍(lán)染色得到的死亡率不超過(guò)12%，細(xì)胞DNA在人參皂苷Rh2作用后發(fā)生降解，瓊脂糖電泳呈梯形條帶。結(jié)論人參皂苷Rh2是一種安全有效毒副作用小的藥物，其對(duì)KBV的抑制作用主要由凋亡引起，并隨著濃度和時(shí)間的不斷增加，持續(xù)作用于耐藥癌細(xì)胞。

口腔鱗癌細(xì)胞;耐藥性;凋亡;Rh2

口腔鱗癌在口腔頜面部的惡性腫瘤中占較高比重，常用的臨床治療手段包括手術(shù)、化學(xué)、放射和靶向治療等，其中化學(xué)治療是術(shù)后最常用的輔助治療手段，但現(xiàn)有臨床藥物大多毒副作用較高，且長(zhǎng)期使用過(guò)程中，細(xì)胞耐藥性使化療效果大大減弱〔1〕。這種現(xiàn)象是由于P-糖蛋白、耐藥性相關(guān)蛋白及凋亡抑制基因等表達(dá)所引起〔2〕。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查，不同程度的耐藥會(huì)導(dǎo)致90%以上的癌癥患者死亡〔3〕。人參皂苷Rh2在腫瘤治療方面安全有效，不僅具有促凋亡、抑生長(zhǎng)、防轉(zhuǎn)移等能力〔4〕；可殺傷膽囊癌、腸癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞〔5～7〕；且對(duì)于乳腺癌、肺癌及肝癌等因化學(xué)藥物產(chǎn)生的耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)作用〔8～12〕，能夠通過(guò)誘導(dǎo)凋亡作用于P-糖蛋白介導(dǎo)的耐藥現(xiàn)象〔13〕。但目前人參皂苷Rh2單體對(duì)口腔鱗癌耐藥細(xì)胞(KBV)的凋亡作用及其對(duì)劑量和濃度的時(shí)效量效關(guān)系尚未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要采用經(jīng)順鉑誘導(dǎo)KBV經(jīng)Rh2作用后，分別通過(guò)檢測(cè)藥物于不同時(shí)間與濃度的生長(zhǎng)抑制率和細(xì)胞死亡率，同時(shí)鑒定細(xì)胞DNA片段，為人參皂苷Rh2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人永生化上皮細(xì)胞(HaCaT)和人口腔鱗癌細(xì)胞(KB)由吉林省腫瘤醫(yī)院供應(yīng)。人參單體Rh2由長(zhǎng)春理工大學(xué)生命學(xué)院提供。細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。曲利苯蘭(臺(tái)盼藍(lán))、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)由北京鼎國(guó)昌盛有限責(zé)任公司提供。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)干粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1KBV制備 通過(guò)梯度濃度(1、2、3、4、5、6 μg/ml)的順鉑誘導(dǎo)KB，用正常和加藥的完全RPMI-1640于37℃、5%CO2條件下間隔培養(yǎng)至耐藥6 μg/ml。6個(gè)月后，將口腔鱗癌及耐藥細(xì)胞按每孔6×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，150 μl/孔細(xì)胞懸液貼壁后，加100 μl的1～6 μg/ml濃度梯度順鉑，設(shè)3個(gè)副孔。培養(yǎng)48 h后棄上清，加20 μl MTT在避光條件下于培養(yǎng)箱中4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)低速搖床10 min，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為490 nm檢測(cè)OD值計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KBV和人永生化上皮細(xì)胞HaCaT，用胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)液調(diào)成濃度為6×103/ml的單細(xì)胞懸液，上述方法鋪板，每孔中添加100 μl含梯度濃度Rh2單體和5-氟尿嘧啶(0、20、40、60、80、100 μg/ml)的完全培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)12、24、48 h。重復(fù)上述MTT測(cè)定過(guò)程檢測(cè)細(xì)胞活性計(jì)算不同時(shí)間與濃度下的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞死亡情況 分別取加藥后12、24和48 h的KBV，胰酶消化重懸后按照9∶1的比例與0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液均勻混合，在室溫下染色3 min后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，計(jì)算5-氟尿嘧啶和Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞死亡率。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KBV，加入不同質(zhì)量濃度的Rh2(20、40、60、80、100 μg/ml)，12 h后通過(guò)提取上藥細(xì)胞基因組在制取濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳來(lái)觀察DNA片段斷裂情況。

2 結(jié) 果

2.1KBV鑒定 在順鉑濃度較低時(shí)對(duì)細(xì)胞活性影響不顯著，而當(dāng)濃度>2 μg/ml時(shí)，正常癌細(xì)胞死亡率增高對(duì)順鉑無(wú)耐受性，而耐藥細(xì)胞活性略有降低但仍高于KB細(xì)胞，KBV對(duì)于順鉑的耐受性明顯高于KB細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 梯度濃度順鉑對(duì)KB及KBV細(xì)胞活性的影響

2.2人參皂苷Rh2對(duì)KBV細(xì)胞的抑制率測(cè)定 設(shè)5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性、完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照，Rh2與5-氟尿嘧啶對(duì)KBV均有抑制作用，同時(shí)其效果隨著濃度與時(shí)間的加強(qiáng)而逐漸增強(qiáng)。其中5-氟尿嘧啶在24 h內(nèi)作用速度快殺傷力強(qiáng)，24～48 h作用減弱，效果弱于初期，而人參皂苷Rh2在48 h內(nèi)對(duì)KBV作用速度增加穩(wěn)定，緩慢作用持續(xù)上升。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度和時(shí)間下Rh2、5-氟尿嘧啶對(duì)KBV細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2.3人參皂苷Rh2對(duì)正常細(xì)胞毒性檢測(cè) Rh2作用于HaCaT細(xì)胞的48 h內(nèi)，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率雖有所增加，但均不超過(guò)10%，且不隨著濃度升高而增加，而相同時(shí)間內(nèi)5-氟尿嘧啶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率不斷增長(zhǎng)，均大于41%，遠(yuǎn)高于Rh2對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度和時(shí)間下藥物對(duì)HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2.4瓊脂糖電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡 圖4結(jié)果顯示，12 h時(shí)細(xì)胞DNA已開(kāi)始降解，在20和40 μg/ml降解現(xiàn)象不明顯，隨著藥物的濃度的上升，在60～100 μg/ml的Rh2作用下，細(xì)胞基因組DNA片段化逐漸明顯，可觀察到明顯梯形條帶，證實(shí)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象產(chǎn)生。

2.5細(xì)胞死亡率檢測(cè) 5-氟尿嘧啶在48 h內(nèi)所引起的細(xì)胞死亡率要遠(yuǎn)高于Rh2，且隨著濃度和時(shí)間正向延伸，5-氟尿嘧啶的死亡率明顯升高，而人參皂苷Rh2較為平緩，由于臺(tái)盼藍(lán)凋亡小體拒染現(xiàn)象，結(jié)合MTT法測(cè)定的抑制率證實(shí)在藥物對(duì)于細(xì)胞的抑制過(guò)程中，Rh2導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要作用在于誘導(dǎo)凋亡，而5-氟尿嘧啶則主要是壞死作用。見(jiàn)表1。

表1 Rh2和5-氟尿嘧啶作用于不同濃度與時(shí)間的細(xì)胞壞死率

A：100 μg/ml B：80 μg/ml C：60 μg/ml D：40 μg/ml E：20 μg/ml F：0 μg/ml G：Marker圖4 不同濃度Rh2對(duì)細(xì)胞DNA的降解作用

3 討 論

口腔鱗癌目前仍是威脅人們生命的重大疾病，由于手術(shù)極易損傷面部，化療成為治療口腔鱗癌最重要的手段，雖然目前常用的臨床治療藥物順鉑、5-氟尿嘧啶及紫杉醇等雖有較好的治療效果，但毒副作用高和致免疫力低下等可引起許多其他疾病的發(fā)生〔13〕，除此外還極易產(chǎn)生耐藥性〔14〕。KBV細(xì)胞是以對(duì)順鉑較為敏感的KB細(xì)胞通過(guò)順鉑濃度梯度刺激后誘導(dǎo)而成，其耐藥程度遠(yuǎn)高于KB細(xì)胞，可作為研究腫瘤細(xì)胞耐藥性的良好材料。郗照勇等〔15〕對(duì)在研究順鉑耐藥的分子機(jī)制的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，順鉑的耐藥主要是通過(guò)抑制凋亡信號(hào)傳導(dǎo)和DNA修復(fù)損傷、減少藥物累積和增強(qiáng)去活作用等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KBV對(duì)順鉑耐受良好，而Rh2在作用于KBV細(xì)胞的48 h內(nèi)，其導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制率在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著時(shí)間與劑量的增加而增加，并且持續(xù)作用于KBV的同時(shí)，對(duì)人體正常細(xì)胞傷害極小，證實(shí)Rh2是一種安全低毒且在體外對(duì)KBV有良好抑制作用的藥物。

細(xì)胞凋亡是在基因控制下自主死亡并可穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的有序過(guò)程，不發(fā)生炎癥反應(yīng)，過(guò)程中細(xì)胞膜保持完整，并在核酸酶作用下發(fā)生DNA降解，因此會(huì)發(fā)生臺(tái)盼藍(lán)拒染現(xiàn)象和產(chǎn)生200 bp左右整倍數(shù)核苷酸片段。本研究中，結(jié)合MTT法與臺(tái)盼藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)MTT法得到的生長(zhǎng)抑制率要遠(yuǎn)高于臺(tái)盼藍(lán)染色得到的死亡率，證實(shí)Rh2導(dǎo)致KBV細(xì)胞的主要死亡方式在于凋亡，并通過(guò)提取藥物作用于KBV細(xì)胞的基因組進(jìn)行DNA電泳所形成的特異性梯狀條帶，發(fā)現(xiàn)KBV從12 h開(kāi)始出現(xiàn)凋亡，并且隨著藥物濃度的上升，DNA降解越完全。

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〔2017-02-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

劉文書(shū)(1966-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事口腔頜面外科研究。

徐亞娟(1965-)，女，主任醫(yī)師，主要從事口腔頜面腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3956-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.021

1 吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院口腔科