劉 欣 毛大華

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

Ki-67在Luminal 型乳腺癌患者中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

劉 欣 毛大華1

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

目的探討Ki-67在Luminal 型乳腺癌患者中的表達(dá)水平與臨床病理的關(guān)系。方法選取2012年8月至2014年8月該院62例乳腺癌患者為研究組，并選取同期來該院體檢的30例乳腺增生患者為對照組，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測兩組組織及血清中Ki-67的表達(dá)，探討Ki-67與臨床病理的相互關(guān)系，并通過低表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中Ki-67后觀察細(xì)胞的增殖與遷移能力。結(jié)果與對照組比較，乳腺癌患者血清及組織中Ki-67的表達(dá)水平均顯著增加(均P<0.05)。Ki-67的mRNA水平在乳腺癌癌組織中的表達(dá)水平亦顯著高于對照組(P<0.05)；相關(guān)分析結(jié)果顯示，Ki-67的高表達(dá)與乳腺癌的臨床分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)。低表達(dá)Ki-67后人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中乳腺癌細(xì)胞的增殖水平顯著降低，遷移能力顯著減少(均P<0.05)。結(jié)論乳腺癌患者體內(nèi)增加的Ki-67水平可能對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有著一定的促進(jìn)作用，其機制可能是通過影響癌細(xì)胞的增殖和遷移水平來發(fā)揮作用。

Ki-67；乳腺癌；增殖；遷移

目前臨床上將乳腺癌主要分為：Luminal型(激素受體表達(dá)腫瘤)、人表皮生長因子受體(HER)2陰型(激素受體陰性)及基底樣型(缺少激素受體及HER2表達(dá))。其中，激素受體陽性型可進(jìn)一步分為Luminal A型和Luminal B型。在腫瘤發(fā)生的病理生理過程中，腫瘤細(xì)胞的異常性增殖以及過度遷移是其中最為關(guān)鍵的部分。Ki-67 是一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其可表達(dá)于除G0期外的所有細(xì)胞周期階段，是近年來認(rèn)為能夠有效判斷細(xì)胞增殖活性指數(shù)的分子指標(biāo)〔1〕。研究認(rèn)為，Ki-67增殖活性高低和乳腺癌的分化程度、浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定的關(guān)系〔2〕，但具體的作用機制尚未明了。本研究旨在分析Ki-67與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，并通過低表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中Ki-67后觀察腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移能力，探討Ki-67影響乳腺癌的分子機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 所有組織來源于2012年8月至2014年8月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬烏當(dāng)醫(yī)院收治的62例Luminal 型乳腺癌患者。其中Luminal A型28例，Luminal B型34例?；颊呔鶠榕?，年齡22～57〔平均(43.5±9.2)〕歲，術(shù)前未經(jīng)放、化療治療。于同期隨機選取的30例乳腺增生患者為對照組，年齡24～54〔平均(45.5±11.4)〕歲。本研究根據(jù)雌激素受體(ER)和(或)孕激素受體(PR)表達(dá)與否，Luminal 型乳腺癌患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)：Luminal A型ER(+)和(或)PR(+)且HER-2(-)；Luminal B型ER(+)和(或)PR(+)且HER-2(+)。 兩組性別、年齡等一般情況無顯著差異(均P>0.05)，具有可比性。患者均知情同意。

1.2主要試劑 組織、血清中的RNA通過Trizol試劑盒(Life Technologies)提??；RNA逆轉(zhuǎn)錄通過cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國PROMEGA公司)進(jìn)行；PCR試劑盒(南京生興生化科技有限公司)。

1.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 清晨空腹時抽取兩組外周靜脈血5 ml，盡快于4℃下4 000 r/min離心5 min。離心后提取上層血清放入-80℃保存?zhèn)溆?。研究者于手術(shù)中取乳腺癌患者及增生患者組織200 mg進(jìn)行試驗，在組織中加入1 ml 的Trizol并充分勻漿，并抽提總RNA，并將其溶于30 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，采用紫外分光光度計對提取的總RNA進(jìn)行定量。同時，將獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃環(huán)境下保存留待后用。Ki-67的引物序列參考文獻(xiàn)〔3〕。U6為對照內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，60℃ 20 s和70℃ 1 s 50個循環(huán)。采用7300型Real-Time PCR儀器(美國ABI公司)進(jìn)行PCR分析，并以2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析〔4〕，最終結(jié)果以相對于對照組的倍數(shù)進(jìn)行描述。

1.4免疫組化及判定標(biāo)準(zhǔn) 取乳腺癌組織標(biāo)本以10%甲醛固定48 h后，石蠟包埋切片為4 μm切片，用Ki-67抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行常規(guī)S-P免疫組化染色，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，光學(xué)顯微鏡觀察棕色的陽性群。細(xì)胞核上的棕褐色顆粒計為Ki-67 陽性。參照腫瘤細(xì)胞的染色程度和染色反應(yīng)強度評估免疫組化的染色結(jié)果。在高倍視野(蔡司Stemi DV4，×100)下隨機選取 10 個不同的視野進(jìn)行統(tǒng)計：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性，5%～25%為+：26%～50%為，51%～75%為。陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/10個視野的細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞(上海研晶生物科技有限公司)采用完全DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)：含不完全DMEM(美國Gibco)10%胎牛血清(美國Gibco)及1%的青鏈霉素(武漢博士德)，以37℃，5% CO2下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(上海英駿)對MCF-7中Ki-67進(jìn)行小RNA干擾，Ki-67的siRNA序列為5′-CCACCAGAGCCAAUAGAUACUUCAG-3′及5′-CUGAAGUAUCUAUUGGCUCUGGUGGUG-3'；對照序列為5′-UCAUAAGUGAUGCUGGAGCTT-3'。用RT-PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.6細(xì)胞侵襲實驗 調(diào)整細(xì)胞密度至(3～5)×105個/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上層，小室下層加入1 ml 10%血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h時間后，取出transwell小室，吸去上層的培養(yǎng)基，終止實驗，使小室于室溫下自然干燥。無水乙醇固定后，采用0.1%結(jié)晶紫于室溫下染色30 min，倒置顯微鏡(蔡司Axio Observer A1m)下觀察己遷移至小室下層的細(xì)胞。隨機選取5個視野后計數(shù)小室下層的細(xì)胞數(shù)目。

1.7細(xì)胞增殖實驗 MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 對照序列及siRNA Ki-67干擾序列后的0、24、48、72 h每孔按1∶10體積比混合無血清必需基本培養(yǎng)基 DMEM 和膽囊收縮素(CCK)-8(Cell signaling)，采用分光光度計于450 nm波長(上海美譜達(dá)，型號 UV-3100)測定每孔OD值，并制作細(xì)胞生長曲線，本實驗每樣5復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗、秩和檢驗和Spearman分析法。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌患者血清及組織中Ki-67蛋白水平比較 Ki-67在乳腺癌患者血清組織中的mRNA表達(dá)水平(3.18±0.62，3.61±0.54)顯著高于對照組(1.05±0.14，1.04±0.11)(t=25.729，36.104；均P=0.000)。

2.2Ki-67在不同組織病理型乳腺癌中的表達(dá) 參照 AJCC乳腺癌TNM分期，Ⅰ期 11例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期31例；Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示乳腺癌組織Ki-67表達(dá)強度與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)呈正相關(guān) (P<0.05)。見表1。

2.3低表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響 MCF-7細(xì)胞低表達(dá)48 h后，MCF-7細(xì)胞中Ki-67 mRNA表達(dá)水平顯著降低；此外，低表達(dá)Ki-67的乳腺癌細(xì)胞的增殖水平顯著增加，48 h及72 h時的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低表達(dá)Ki-67的乳腺癌細(xì)胞的遷移能力減少(P<0.05)。見表2。

表1 Ki-67表達(dá)與乳腺癌TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(n)

1)有2例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

表2 低表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響(±s,n=5)

與Blank組比較：1)P<0.05，與Control組比較：2)P<0.05；與0 h時點比較：3)P<0.05

3 討 論

乳腺癌在我國的某些地區(qū)發(fā)病率已上升為女性惡性腫瘤的第一位，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年增加，并且有年齡年輕化的趨勢。惡性腫瘤最為重要的生物學(xué)特性為侵襲轉(zhuǎn)移，同時也是引起乳腺癌患者死亡的主要原因〔4〕，然而，其具體的致病過程和病理學(xué)機制尚不完全清楚。研究表明，Ki-67是一種定位于第 10 號染色體上的基因，可以識別增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)的核蛋白，起作用主要與細(xì)胞的有絲分裂密切關(guān)聯(lián)，尤其與腫瘤細(xì)胞的增殖息息相關(guān)〔4～6〕。然而，關(guān)于Ki-67與Luminal 型乳腺癌之間的關(guān)系，其在乳腺癌發(fā)病機制中的作用，目前相關(guān)的研究相對較少。

本研究結(jié)果提示Ki-67可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Warth等〔7〕在非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)水平增加，并且可以作為預(yù)測指標(biāo)；Pollack等〔8〕和Khor等〔9〕在前列腺癌患者體內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)顯著增加；此外，Inwald等〔10〕在乳腺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)顯著增加，并且可以作為預(yù)測乳腺癌發(fā)病的指標(biāo)。本研究結(jié)果提示Ki-67的高表達(dá)參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，進(jìn)一步說明Ki-67在乳腺癌組織中發(fā)揮重要的促進(jìn)腫瘤形成及轉(zhuǎn)移的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)膀胱癌細(xì)胞中Ki-67水平后能夠抑制腫瘤的生長〔11〕。本研究結(jié)果說明了Ki-67可能影響通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖水平影響著乳腺癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的惡性程度。

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〔2016-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

毛大華(1964-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事乳腺腫瘤研究。

劉 欣(1983-)，男，主治醫(yī)師，主要從事乳腺腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3954-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.020

1 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬烏當(dāng)醫(yī)院乳腺外科