范煥芳 黃 茂 單保恩 王 玲 韓長輝

(河北省中醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050011)

小鼠食管癌前病變組織P53表達及化濁潤燥降氣方的干預(yù)作用

范煥芳 黃 茂1單保恩2王 玲2韓長輝

(河北省中醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050011)

目的觀察小鼠食管癌前病變組織P53的表達及中藥復(fù)方化濁潤燥降氣方的干預(yù)作用。方法將130只小鼠分為正常組、模型組、陽性對照組、中藥預(yù)防組、中藥治療組，采用4-硝基喹啉-氧化物(4-NQO)制備小鼠食管癌前病變模型，采用流式細胞檢測、免疫組織化學(xué)方法觀察各組食管組織中P53的表達。結(jié)果14 w末食管癌前病變模型成功。流式細胞檢測：模型組小鼠P53表達水平與正常組相比明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、中藥預(yù)防組、中藥治療組P53較模型組明顯降低(P<0.05)；中藥預(yù)防組與陽性對照組P53表達無明顯差異(P>0.05)；中藥預(yù)防組P53表達明顯低于中藥治療組(P<0.05)。免疫組織化學(xué)檢測示陽性對照組與模型組P53表達無明顯差異(P>0.05)；中藥預(yù)防組、中藥治療組分別與模型組及陽性對照組明顯降低(P<0.05)；中藥預(yù)防組低于中藥治療組(P<0.05)。結(jié)論小鼠食管癌前病變組織存在P53高表達。化濁潤燥降氣方能降低食管癌前病變小鼠P53的表達。

食管癌前病變；化濁潤燥降氣方；4-硝基喹啉-氧化物；P53

我國是食管癌高發(fā)國家，發(fā)病率為22.14/10萬，居各類惡性腫瘤第5位，死亡率為16.77/10萬，居第4位〔1〕，5年總生存率低于20%〔2〕。食管中度和重度不典型增生是食管癌變過程中的必經(jīng)階段，逆轉(zhuǎn)食管癌前病變向正常細胞分化具有重要意義。P53是與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。本文觀察小鼠食管癌前病變組織P53的表達及化濁潤燥降氣方的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取清潔級健康SPF級C57BL/6小鼠130只，雌雄各半，4周齡，體重17～20 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2藥物制備：造模藥物4-硝基喹啉一氧化物(4-NQO)購自Sigma公司。將1 g 4-NQO溶于50 ml蒸餾水，配成濃度為2%的稀釋液，4℃冰箱避光保存。使用時取0.5 ml 2%原液加入100 ml飲用水中，配成100 μg/ml濃度。每100 g小鼠每日用4-NQO 2 500 μg，即口服25 ml含有4-NQO的飲用水。陽性對照組藥物全反式維甲酸(ATRA)(購自Sigma 公司)。使用時將30 mg ATRA 溶于20 ml稀釋后的甲基纖維素中，每20 g小鼠每次灌胃劑量為0.15 mg，每周3次。化濁潤燥降氣方：組成：丹參、沙參、郁金、砂仁、荷葉、茯苓、浙貝母、藿香、佩蘭、冬凌草、全蝎。由河北省中醫(yī)院藥學(xué)部提供，每付中藥生藥含量131 g，免煎顆粒為13.7 g，小鼠用量與人用量的比例為0.002 6∶1，每20 g小鼠服用0.2 ml含有中藥的水溶液。

1.3主要試劑及儀器 兔抗P53多克隆抗體(Santa Cruz公司)；免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(北京中杉金橋生物有限公司)；Epics-XLⅡ型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.4分組及模型制備 采用隨機分組的方法將130只小鼠分為正常組、模型組、陽性對照組、中藥預(yù)防組、中藥治療組，正常組、陽性對照組各20只，其余每組30只。各組雌雄小鼠數(shù)目無明顯差異，雌雄分籠。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不做特殊處理。其余110只小鼠，每日飲用100 μg/ml的4-NQO水溶液，正常喂養(yǎng)飼料。中藥預(yù)防組在開始造模同時給予化濁潤燥降氣方灌胃，每周3次，劑量為20 g小鼠服用0.2 ml濃縮中藥免煎顆粒。各組小鼠在給藥期間每周測體重一次，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。14 w末癌前病變模型成功，小鼠停用4-NQO水溶液。之后模型組常規(guī)飼養(yǎng)；陽性對照組小鼠開始給予ATRA，劑量為每20 g每次灌胃劑量為0.15 mg，每周3次；中藥預(yù)防組小鼠繼續(xù)給予化濁潤燥降氣方灌胃，劑量如前；中藥治療組小鼠在模型制備成功時開始給予化濁潤燥降氣方灌胃，用量同預(yù)防組。24 w末模型組5只小鼠食管上皮均有癌變，全部處死小鼠，取食管標本，進行各組指標檢測。

1.5流式細胞術(shù)測定各組小鼠P53的表達 制備單細胞懸液，取單細胞懸液1×106/ml 0.1 ml，加入鼠抗人單克隆抗體工作液 0.1 ml，室溫孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)10 ml洗滌一次，棄上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光、室溫孵育30 min，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清以除去未結(jié)合的熒光二抗，上機檢測前加入PBS 0.1 ml經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上機檢測。以x-mode值作為統(tǒng)計量。

1.6免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)SP法檢測食管上皮組織P53蛋白表達。將食管組織脫蠟和水化，PBS沖洗，滴加一抗，滴加生物素二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶-鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min。DAB顯色：蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染；透明；中性樹脂50 μl封片，室溫保存。采用HMIAS-2000高清晰度彩色分析系統(tǒng)。每組選6張切片，每張切片測10個區(qū)域，對每個區(qū)域進行平均光度值測定。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1流式細胞術(shù)檢測各組食管上皮組織P53表達變化 正常組P53 x-mode值為(4.23±0.55)；模型組(25.43±2.94)較正常組明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、中藥預(yù)防組、中藥治療組P53表達水平分別為(8.85±1.76)、(7.23±0.72)、(11.40±2.03)，三組均較模型組明顯降低(P<0.05)；中藥預(yù)防組與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)；中藥預(yù)防組明顯低于中藥治療組(P<0.05)。

2.2免疫組織化學(xué)法檢測各組小鼠食管上皮組織中p53蛋白表達變化 P53蛋白主要表達于細胞核和細胞質(zhì)，其細胞核及細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性。正常組P53的平均光度為(0.136±0.015)；模型組(0.208±0.012)較正常組明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、中藥預(yù)防組、中藥治療組分別為(0.202±0.021)、(0.171±0.008)、(0.193±0.018)，陽性對照組與模型組無明顯差異(P>0.05)；中藥預(yù)防組、中藥治療組分別較模型組明顯降低(P<0.05)；中藥預(yù)防組、中藥治療組較陽性對照組明顯降低(P<0.05)；中藥預(yù)防組顯著低于中藥治療組(P<0.05)，見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測小鼠食管上皮組織P53表達(DAB，×400)

3 討 論

研究表明，食管癌發(fā)生與亞硝胺類化合物、吸煙、飲酒、真菌、病毒等外界環(huán)境因素影響有關(guān)，但更主要的是與其本身的基因改變相關(guān)〔3〕。野生型P53基因是人體內(nèi)功能最強大的抑癌基因，它對細胞周期和凋亡起關(guān)鍵性作用。P53基因能夠阻斷一種血管生成基因的表達，抑制腫瘤內(nèi)部血管形成，有效防止腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移并提高人體自身的免疫功能。另外，P53基因還有修復(fù)受損基因的作用?；蚴軗p時P53連接DNA，然后由蛋白質(zhì)群合力修復(fù)受損DNA。如果DNA損傷過度無法修復(fù)，P53基因就會誘導(dǎo)細胞進入凋亡狀態(tài)。P53基因作為一個重要的抗癌基因調(diào)控DNA修復(fù)、細胞周期停滯和誘導(dǎo)細胞凋亡，維持基因組和細胞穩(wěn)定，使癌細胞自殺，防止癌變〔4〕。但是一旦該基因發(fā)生突變，導(dǎo)致細胞無節(jié)制的分裂，就容易引發(fā)癌癥。

黃志軍〔5〕探討食管癌、癌旁組織中P53、MDR-1基因的表達及相關(guān)性，結(jié)果表明，突變型P53在食管癌、癌旁組織中均呈高水平表達，P53基因突變早于組織形態(tài)學(xué)改變。任秀花等〔6〕采用免疫組化方法檢測P53蛋白在45例原發(fā)性食管鱗癌大體標本中的不同病變區(qū)域的表達。結(jié)果表明，P53蛋白在食管癌自然病史中呈現(xiàn)漸進性高表達，其在單純增生和不典型增生中表達有明顯性差異，提示P53蛋白基因的改變在食管癌發(fā)生的早期就出現(xiàn)了，即發(fā)生了基因突變，同時從另一個側(cè)面提示在食管癌前病變階段觀察中藥單方或復(fù)方的干預(yù)作用對于探討中藥的具體作用機制具有重要意義。

食管癌前病變屬“噎膈”范疇〔7〕。啟膈散具有潤燥降氣、開郁化痰的作用，可以治療噎膈輕癥患者?；瘽釢櫾锝禋夥绞窃诿絾㈦跎⒌幕A(chǔ)上加化濁通絡(luò)解毒之品藿香、 佩蘭、冬凌草、天龍、全蝎而成，全方共奏化濁解毒、化痰解郁、通絡(luò)散結(jié)之效。本研究結(jié)果表明，食管癌前病變小鼠發(fā)展為食管癌時存在P53的高表達，化濁潤燥降氣方能夠抑制P53的表達而阻斷食管癌前病變的進展。

1赫 捷,陳萬青.中國腫瘤登記年報〔M〕.北京.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2012：28-30.

2Kim T,Grobmyer SR,Smith R,etal.Esophageal cancer:the five year survivors〔J〕.J Surg Oncol,2011;103(2):179-83.

3邰智慧,張 科,李淑英,等.人乳頭瘤病毒感染與不同地域食管癌發(fā)生相關(guān)性Meta 分析〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(18):4451-3.

4賈春平.抑癌基因P53與腫瘤研究的最新進展〔J〕.生命科學(xué),2008;20(3):450-3.

5黃志軍.食管癌、癌旁組織中P53、MDR-1 基因的表達〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(7):1782-4.

6任秀花,郭 坤,李珊珊,等.食管癌及癌前病變中p53、CD44v6蛋白的表達及其意義〔J〕.河南腫瘤學(xué)雜志,2004;17(3):161-2.

7霍炳杰,徐江紅,邢筱華.劉亞嫻教授治療食管癌前病變經(jīng)驗〔J〕.河北中醫(yī),2011;33(4):488-9.

〔2016-04-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省高層次人才資助項目(No.B2012003007)

單保恩(1962-)，男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，主要從事惡性腫瘤研究。

范煥芳(1970-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事惡性腫瘤研究。

R732

A

1005-9202(2017)16-3950-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.018

1 河北省中醫(yī)院兒童康復(fù)科 2 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心