白春艷 孫宏俠 胡軼虹 劉 敏 周 艷 李宗樹 張明明 王 凱

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 130021)

重組pIRES-AD7c-NTP質(zhì)粒對神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激水平的影響

白春艷 孫宏俠 胡軼虹 劉 敏 周 艷 李宗樹 張明明 王 凱

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的將構(gòu)建好的重組pIRES-AD7c-NTP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC12細胞內(nèi)，探究AD7c-NTP上調(diào)對神經(jīng)細胞氧化損傷的影響。方法MTT實驗檢測重組pIRES-AD7c-NTP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對細胞增殖的抑制作用，研究受損細胞一氧化氮合酶(NOS)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見明顯的細胞增殖抑制作用，NOS活性明顯增高，而SOD活性明顯降低，出現(xiàn)明顯的細胞死亡。結(jié)論重組pIREs-AD7c-NTP質(zhì)?？蓪?dǎo)致神經(jīng)細胞發(fā)生氧化損傷。

阿爾茨海默病相關(guān)神經(jīng)絲蛋白；PC12細胞；超氧化物歧化酶；一氧化氮合酶

阿爾茨海默病(AD)相關(guān)神經(jīng)絲蛋白(AD7c-NTP)在AD患者腦內(nèi)選擇性增高。尿液中AD7c-NTP含量測定可以很好反映AD患者的腦內(nèi)神經(jīng)元內(nèi)該蛋白濃度〔1〕，而且兼有較好的特異性和敏感性，操作簡便，是輔助診斷 AD較好的生物學(xué)指標(biāo)。我們通過構(gòu)建重組pIRES-AD7c-NTP質(zhì)粒并表達在PC12細胞內(nèi)，觀察其對神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激水平的影響。氧化應(yīng)激與AD有著密切的關(guān)系〔2〕。本文觀察重組pIRES-AD7c-NTP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC12細胞內(nèi)，上調(diào)對神經(jīng)細胞氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑 PC12細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京中杉生物技術(shù)公司，兔抗人AD7c-NTP抗體購自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實驗室，RT-PCR試劑盒由日本TaKaRa公司提供,一氧化氮合酶(NOS)及超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒由南京建成生物有限公司提供，MTT由Hyclone公司提供，pIRES-AD7c-NTP質(zhì)粒由Clontech公司提供，重組表達載體pIRES-AD7c-NTP由本課題組制備。

1.2PC12細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 PC12細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于5%的CO2、37℃恒溫孵箱中，2～3 d傳代1次。細胞轉(zhuǎn)染前24 h，用含10%胎牛血清的無抗生素培養(yǎng)液懸浮，接種在細胞培養(yǎng)板中，密度為5×105/ml。5%CO2，37℃培養(yǎng)18～24 h，使細胞融合達50%～80%。0.5 μl脂質(zhì)體2000和0.2 μg質(zhì)粒分別稀釋于25 μl不含血清和抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫靜置5 min。質(zhì)粒稀釋液中加入上述25 μl脂質(zhì)體2000稀釋液，輕柔混勻，室溫孵育20 min。將50 μl脂質(zhì)體2000/質(zhì)粒混合物滴加到96孔培養(yǎng)板中，輕微搖晃，使培養(yǎng)液混勻。5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4 h后細胞換液，除去脂質(zhì)體，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3脂質(zhì)體2000介導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)染最佳質(zhì)粒/脂質(zhì)體比值的確定 取對數(shù)生長期細胞，消化后以5×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，使細胞融合達50%～80%。棄去細胞培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1次，備轉(zhuǎn)染。分別按照一定含量配制脂質(zhì)體2000/質(zhì)?；旌衔镞M行轉(zhuǎn)染。

1.4MTT法檢測細胞增殖變化 實驗共分三組：空白對照組：不轉(zhuǎn)染，細胞中加入同等體積無血清培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP空白質(zhì)粒的陰性對照組：用空質(zhì)粒pIRES-EGFP/脂質(zhì)體2000混合物進行轉(zhuǎn)染；pIRES-AD7c-NTP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組：用重組載體pIRES-AD7c-NTP/脂質(zhì)體2000混合物進行轉(zhuǎn)染。細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.5NOS含量測定 將對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，分組進行轉(zhuǎn)染(方法同前)。轉(zhuǎn)染48 h后，取各組細胞培養(yǎng)上清液，按NOS試劑盒說明加入試劑，在紫外分光光度計(530 nm)測定吸光度，按公式計算培養(yǎng)液中NOS含量。

1.6SOD含量測定 對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，分組進行轉(zhuǎn)染(方法同前)。48 h后，收集各組細胞，用Triton X-100進行破碎，分別裝入5 ml有蓋試管中，按照試劑盒說明書加入各試劑，在紫外分光光度計(550 nm)測定吸光度，按公式計算培養(yǎng)液中的SOD含量。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各處理組細胞增殖情況比較 PC12細胞轉(zhuǎn)染后48～72 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，陰性對照組細胞生長狀態(tài)良好，細胞貼壁生長，表面光滑，折光性好，呈多角形生長，細胞表面形成突起，清晰可見，細胞增殖旺盛；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，隨著轉(zhuǎn)染時間延長，細胞逐漸變圓，胞質(zhì)回縮，細胞突起消失，折光性差，細胞膜表面不光滑，出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，部分細胞出現(xiàn)死亡。空白與對照(0.892±0.004)組相比，陰性對照組細胞體外增殖活性無明顯差異(0.886±0.003，P>0.05)，其抑制率為0.67%；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見明顯的抑制細胞增殖作用細胞增殖為0.564±0.003，細胞生長抑制率為36.77%。

2.2各組細胞NOS及SOD活性比較 與空白對照組比較，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中NOS活性明顯增高(P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。與空白對照組比較，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中SOD活性明顯降低(P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組無顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞NOS、SOD活性的比較(±s，n=3)

與空白對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

目前AD的病因及其病理機制仍未明確，存在多種學(xué)說和假設(shè)，包括氧化應(yīng)激和線粒體缺陷學(xué)說、Aβ學(xué)說、膽堿能學(xué)說、基因?qū)W說、晚期糖基化終產(chǎn)物的諸多學(xué)說，國內(nèi)外學(xué)者以此為依據(jù)形成了不同的診斷策略。在眾多學(xué)說中，氧化應(yīng)激和線粒體缺陷學(xué)說占據(jù)著重要的地位〔3～6〕。腦組織病理檢查證明，AD患者腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)處存在大量的神經(jīng)元凋亡，所以盡管AD的發(fā)病機制非常復(fù)雜，一種假說難以完全解釋清楚，但腦內(nèi)線粒體缺陷和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元退變被認為是發(fā)生在AD最早期的事件，是造成AD的最重要的病理因素之一。因此，從氧化應(yīng)激和線粒體缺陷角度研究AD的發(fā)病機制，將為AD的診斷和治療提供新的思路。

正常情況下，機體內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，當(dāng)ROS蓄積過多就會攻擊機體，ROS產(chǎn)生過多是氧化應(yīng)激的主要原因。在生理狀態(tài)下的ROS具有刺激細胞生長的作用；而在外界各種因素作用(如Aβ沉積、鐵離子生成等)下，ROS產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡就會被打破，就會導(dǎo)致大量ROS在體內(nèi)堆積，對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。在AD患者腦內(nèi)，特別是在神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)中，發(fā)現(xiàn)了大量氧化應(yīng)激終產(chǎn)物〔7～9〕如：丙二醛、過氧化亞硝酸鹽、羰基、糖基化終末產(chǎn)物、血紅素氧合酶-1和SOD-1等；AD患者尸檢資料也證實，在NFTs形成部位存在著蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物、羰基和脂質(zhì)過氧化物的增加，這都提示了自由基所介導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與了AD患者特征性病理結(jié)構(gòu)的形成過程。

體外實驗表明,胰島素刺激SH-Sy5y和PNET 2細胞會引起內(nèi)源性AD7c-NTP表達的增加和磷酸化反應(yīng)增強〔10〕。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在AD7c-NTP轉(zhuǎn)染的細胞中,受損的胰島素/胰島素樣生長因子(IGF)-1信號通路可能介導(dǎo)了神經(jīng)元的死亡,而且中樞神經(jīng)元如果含有大量胰島素或IGF-1受體，可能對AD7c-NTP引起的損害效應(yīng)尤其易感〔11〕。人類組織學(xué)研究也揭示，AD7c-NTP在AD腦顳葉和額葉的表達水平較對照組高,并且通過原位雜交和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在組織學(xué)尚完整的變性神經(jīng)元中出現(xiàn) AD7c-NTP表達的增加〔10〕。所以AD7c-NTP不僅是AD神經(jīng)元變性的一種標(biāo)記分子，也在AD發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。

本文結(jié)果顯示，AD7c-NTP的過度表達可導(dǎo)致細胞凋亡及氧化損傷。關(guān)于氧自由基與AD7c-NTP的關(guān)系以及AD7c-NTP功能的研究目前尚不多見，它究竟是突變基因表達的產(chǎn)物，還是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和加工過程異常累積的結(jié)果，它在腦的正常功能中占據(jù)什么樣的地位，在AD病理改變中發(fā)揮什么樣的作用以及導(dǎo)致細胞凋亡的原因，有待于進一步研究。

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〔2016-02-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

吉林省科委課題(No.200705464)

孫宏俠(1964-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事認知障礙及腦血管病研究。

白春艷(1974-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事周圍神經(jīng)疾病研究。

R749

A

1005-9202(2017)16-3948-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.017