段云燕 杜 娟 段永強 梁麗娟 楊曉軼 梁玉杰 成映霞 朱立鳴 雒 軍

(甘肅中醫(yī)藥大學 敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

敦煌石室大寶膠囊對衰老大鼠血清白細胞介素-4、-10含量和海馬區(qū)熱休克蛋白86基因蛋白表達的影響

段云燕 杜 娟 段永強 梁麗娟1楊曉軼 梁玉杰1成映霞 朱立鳴 雒 軍

(甘肅中醫(yī)藥大學 敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

目的觀察以健脾補腎-滌痰祛瘀法為指導的敦煌石室大寶膠囊(DHDB)對衰老模型大鼠血清白細胞介素(IL)-4、IL-10含量和海馬區(qū)熱休克蛋白(HSP)86基因和蛋白表達的影響。方法受試動物按隨機數(shù)字表法分為空白組(n=10)和模型組(n=50)。采用D-半乳糖(0.125 g/kg)皮下注射建立衰老模型并篩選符合衰老模型的大鼠，按隨機數(shù)字表法分為模型組、DHDB高、中、低劑量組(0.8、0.4、0.2 g/kg)和陽性對照組(0.4 g/kg吡拉西坦)，經(jīng)藥物干預后分別測定各組大鼠血清IL-4、IL-10含量和海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達水平。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠學習能力下降，血清IL-4含量顯著降低、IL-10含量顯著增高，海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)；DHDB各劑量組大鼠學習能力提高，血清IL-4含量顯著增高而IL-10含量顯著降低，海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達水平顯著增高，且以高劑量DHDB作用為優(yōu)(P<0.05)。結(jié)論DHDB具有提高衰老大鼠學習記憶能力，調(diào)節(jié)血清IL-4、IL-10含量正常分泌及促進海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達的作用。

白細胞介素-4；白細胞介素-10；熱休克蛋白86；腦海馬組織；敦煌石室大寶膠囊；衰老

目前，應用中醫(yī)藥防治老年癡呆具有一定的優(yōu)勢。研究表明，敦煌石室大寶膠囊(DHDB)可通過調(diào)節(jié)衰老大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、三磷酸腺苷酶活性以及鈣穩(wěn)態(tài)等改善腦功能〔1，2〕。本課題擬探討DHDB對衰老大鼠血清白細胞介素(IL)-4/IL-10含量和海馬區(qū)熱休克蛋白(HSP)86基因蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物、藥物、儀器及試劑 SPF級Wistar大鼠，3月齡，雌雄各半，體重180～220 g，由甘肅中醫(yī)學院醫(yī)學實驗中心提供。動物合格證號：SCXK(甘)2011-0001-0096；SPF級實驗設施合格證：SYXK(甘)2011-0001-00000119。DHDB(甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，甘藥制字Z04010872，0.45 g/粒，批號130420)；陽性對照藥(吡拉西坦片，黑龍江百泰藥業(yè)有限公司，批號120805)。Y型水迷宮，甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心自制；酶聯(lián)免疫檢測儀(規(guī)格型號：BENCHMARK PULS，美國BIO-RAD)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(規(guī)格型號：L-303，金壇市恒豐儀器廠生產(chǎn))。D-半乳糖(北京索萊寶生物科技有限公司，批號1205A0510)；IL-4、IL-10測試盒，批號：130450145，杭州聯(lián)科生物技術有限公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，批號ZB-2301，北京中杉金橋生物科技有限公司；HSP86、β-actin引物：寶生物工程(大連)有限公司；Trizol 試劑(批號AK7208-1)、反轉(zhuǎn)錄及Real Time qPCR試劑盒(批號0000036802)均購自Promega Corporation；抗HSP86抗體(批號B4169)：美國ImmunoWay公司。

1.2動物分組 受試動物適應性飼養(yǎng)3 d后，通過水迷宮學習能力評估篩選60只大鼠并按體重編號，采用隨機數(shù)字表法抽取10只為空白組，其余50只大鼠按文獻〔3〕造模。所有動物在統(tǒng)一條件下(室溫18℃，相對濕度30% 左右)以標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3造模與給藥 采用每日給予造模大鼠頸部皮下注射D-半乳糖(0.125 g/kg)，連續(xù)注射6 w，造成擬亞急性大鼠衰老模型，模型建立成功后用跳臺法篩選符合衰老行為標準大鼠，再將模型動物按照隨機數(shù)字表法分為模型組、DHDB高、中、低劑量組和陽性對照組，每組10只。并給予DHDB灌胃治療，等效劑量以成人常規(guī)劑量按人與動物體型系數(shù)折算〔4〕：即DHDB高、中、低劑量組給予0.8，0.4和0.2 g·kg-1·d-1DHDB藥劑灌胃(相當于成人劑量的10、5和2倍)；給予陽性對照組0.4 g·kg-1·d-1吡拉西坦片藥劑灌胃(相當于成人劑量的5倍)。各組均以蒸餾水、標準飼料喂養(yǎng)，連續(xù)灌胃40 d，給藥容積為1 ml/100 g體重，因灌胃操作不當，模型組和DHDB低劑量組各死亡2只大鼠，DHDB高、中劑量組和陽性對照組各死亡1只大鼠。

1.4各組大鼠學習能力評估〔3〕受試大鼠處理第41天后開始進行水迷宮學習能力訓練，大鼠進入水臂直接游至安全臂?？颗_為正確，反之進入另一臂則為錯誤。學習能力以達到連續(xù)9次正確所需的次數(shù)為指標，超過30次則記為30，并記錄每次達到安全臺所需的時間作為潛伏時間。連續(xù)訓練5 d，訓練結(jié)束后間隔1 d，即第47天進行記憶能力測試，記憶能力以15次中正確的次數(shù)為指標，并記錄每次的潛伏時間。

1.5組織取材與標本制備 各組動物于記憶能力測試結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將大鼠麻醉，股動脈取血后斷頭處死，血清標本制備：大鼠股動脈采血4 ml，37℃水中放置30 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清4℃冰箱保存，待測效應指標。腦組織常規(guī)固定和勻漿制備：采血處死后低溫條件下快速取出腦組織，一部分腦組織置入4%多聚甲醛中固定后制作病理切片待免疫組化檢測HSP86蛋白備用。腦海馬組織的收集：大鼠處死后迅速將腦海馬組織定位取出后置于用DEPC處理過的凍存管中，于-80℃冷凍保存待測HSP86 基因表達備用。

1.6實時熒光定量PCR檢測腦海馬區(qū)HSP86基因表達水平 取適量腦組織，用Trizol 試劑提取腦組織總RNA，按照試劑盒說明書操作步驟，獲得cDNA 產(chǎn)物，并進行PCR反應，β-actin 為內(nèi)參。實時熒光定量PCR以β-actin作為內(nèi)參基因，相同模板相同基因設3復孔、6次平行實驗，得到各擴增反應的Ct值。反應體系據(jù)GoTaq 2-Step RT-qPCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書配制。β-actin引物序列：上游序列5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游序列5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴增長度為150 bp；HSP86引物序列為：上游5′-CTGACAGAATGACAAGTCTGTGAA-3′，下游5′-CAGTTACAGCAGCACTGGTATCATC-3′，擴增長度為162 bp。反應參數(shù)：預變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循環(huán)40次，終末延伸65 ℃、5 s，95 ℃ 15s。連續(xù)檢測熒光并記錄擴增曲線，采用樣點擬合法分析結(jié)果得到目的基因和β-actin的Ct值，并用比較Ct值法計算相對表達量：ΔΔCt=(測試組目的基因Ct值-測試組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)，相對表達量=2-ΔΔCt。

1.7免疫組化法檢測腦海馬區(qū)HSP86蛋白表達水平 腦組織塊浸于4%多聚甲醛中固定后，經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做連續(xù)切片，片厚4 μm。取各大鼠等部位切片3張，經(jīng)二甲苯二級脫蠟各5 min，梯度酒精脫水，高壓熱修復后分別滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠HSP86一抗4℃過夜，次晨取出置常溫，PBS緩沖液沖洗后，滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB顯色，水沖洗后蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，胞質(zhì)黃染。應用 BI-2000 多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對免疫組化切片進行圖像分析，每個部位取5個視野，分別測量同一視野中反映免疫反應物陽性強度的平均光密度、分布密度數(shù)值并以平均數(shù)進行分析。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行F及q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學習能力及學習潛伏時間比較 與空白組比較，模型組大鼠的9次正確所需次數(shù)顯著升高，學習潛伏時間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較，DHDB高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠9次正確所需次數(shù)顯著降低，學習潛伏時間顯著縮短，以DHDB高劑量組和陽性對照組作用顯著(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2各組大鼠血清IL-4和IL-10含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清IL-4含量顯著降低，而IL-10含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，DHDB高、中劑量組和陽性對照組大鼠血清IL-4含量顯著升高，IL-10含量顯著降低，以DHDB高劑量組和陽性對照組作用顯著(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 各組大鼠學習能力及學習潛伏時間比較 (±s)

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

表2 各組大鼠血清IL-4和IL-10含量比較(±s,pg/ml)

2.3各組大鼠腦海馬組織HSP86基因表達水平比較 與空白組(1.00)比較，模型組大鼠腦組織HSP86基因表達顯著降低(0.79±0.052，P<0.01)；與模型組比較，DHDB高、中劑量組(0.91±0.047、0.82±0.060)和陽性對照組(0.88±0.057)大鼠腦組織HSP86基因表達顯著升高，以DHDB高劑量組和陽性對照組作用顯著(P<0.05)。DHDB低劑量組(0.80±0.084)與模型組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.4各組大鼠腦海馬組織HSP86蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組大鼠腦組織HSP86蛋白表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，與模型組比較，DHDB高、中、低劑量組和陽性對照組可提高腦組織HSP86蛋白表達水平，且以DHDB高劑量組和陽性對照組作用顯著(P<0.05，P<0.01)。見表3，圖1。

表3 各組大鼠腦海馬組織HSP86蛋白表達水平比較(±s,n=6)

圖1 各組大鼠腦海馬組織HSP86蛋白表達(DAB，×400)

3 討 論

多年來中醫(yī)藥領域關于防治阿爾茨海默病(AD)的研究不斷深入，尤其是中醫(yī)藥在改善癥狀、提高生活質(zhì)量等方面已體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢〔4，5〕。中醫(yī)學在長期的臨床實踐中，結(jié)合歷代醫(yī)家關于衰老的學術觀點歸納出“五臟虛衰，痰瘀內(nèi)阻”是發(fā)生AD的主要病因病機之一，尤其以“脾腎兩虛，痰瘀內(nèi)阻”為主〔6〕，此如《三因極一病證方論·健忘證治》所云：“今脾受病，則意念不清，心神不寧，使人健忘，盡心力思量不者，是也”；另如《醫(yī)方集解·補養(yǎng)之劑》云：“人之精與志皆藏于腎，腎精不足則志氣衰，不能上通于心……迷惑善忘也”，故“健脾補腎、滌痰祛瘀”法已成為臨床防治AD的主要法則之一。本課題所研究的中藥制劑DHDB是挖掘敦煌醫(yī)學古醫(yī)方學術精粹并結(jié)合名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗化裁而成，由熟地、黃芪、當歸、茯苓、大黃、三七等藥物經(jīng)過提取、分離而成，具有強腎填精、健脾益氣、滌痰祛瘀、安和五臟的功效。前期研究表明〔7，8〕DHDB不但可調(diào)節(jié)衰老大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)以及鈣穩(wěn)態(tài)等改善腦功能，還可能夠通過降低衰老大鼠腦組織單胺氧化酶B 型活性，提高三磷酸腺苷酶活性而保護腦細胞的功能。目前認為增齡性衰老或癡呆等老年認知功能障礙的發(fā)病機制亦系多因性、綜合性及復雜性病理過程〔9〕，近年又強調(diào)炎性衰老、促炎/抗炎細胞因子網(wǎng)絡失衡，最終可引起機體衰老加速〔10〕。研究表明〔11〕抗炎細胞因子網(wǎng)絡對炎性細胞因子有拮抗作用并形成動態(tài)平衡，維持機體的炎性功能正常，如該動態(tài)平衡被破壞，將導致促炎反應狀態(tài)增齡性升高，導致炎性衰老的發(fā)生與發(fā)展，同時炎性衰老和免疫衰老可互為因果，相互作用，形成惡性循環(huán)，進一步加重增齡性疾病發(fā)生發(fā)展。在細胞因子中，IL-4主要由活化的T細胞和肥大細胞產(chǎn)生，能抑制炎癥因子的產(chǎn)生，從而參與緩解炎癥過程及某些自身免疫疾病的發(fā)生。IL-10主要由Treg細胞分泌，后者在免疫反應中主要發(fā)揮負調(diào)控作用，而且IL-10可聯(lián)合轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β產(chǎn)生廣泛的非特異性抑炎作用，還可通過接觸抑制Th1、Th2型免疫反應；研究表明〔12〕在衰老過程中，可能存在著一定的調(diào)節(jié)機制促進IL-10和TGF-β等細胞因子表達并參與免疫衰老的發(fā)生。同時有研究表明在細胞抗衰老過程中，分子伴侶亦起著重要作用〔13，14〕，其中分子伴侶HSP86在腦衰老中的作用主要包括以下作用〔15，16〕：其一是發(fā)揮細胞保護作用，如細胞產(chǎn)生的HSPs可以增強其對損害的耐受程度，維持細胞的正常功能代謝；其二是參與調(diào)控細胞凋亡，HSPs對氧化應激、熱休克、電離輻射等引起的凋亡具有保護作用；其三是抗氧化應激作用，增加HSPs可以提高氧化損傷蛋白的修復功能，從而保護氧化應激對神經(jīng)細胞的損傷。本研究結(jié)果顯示DHDB具有促進大鼠學習記憶能力、調(diào)整細胞因子IL-4/IL-10正常分泌以及上調(diào)HSP86基因和蛋白表達進而提高腦組織細胞保護和損傷耐受的作用。

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〔2016-05-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室開放基金(No.DHYX1213-009)；甘肅省科技攻關計劃項目(No.2GS064-A43-020-22)；蘭州市科技局計劃項目(No.06-2-87)

段永強(1974-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治老年病、脾胃病研究。

段云燕(1972-)，女，實驗師，主要從事中藥方劑配伍規(guī)律和脾胃病教學研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)16-3945-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.016

1 甘肅中醫(yī)藥大學 甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)新工程重點實驗室