朱振標(biāo) 張 壽 沈 慧 林之斌 丁曉莉 劉亦恒

(海口市人民醫(yī)院骨科中心，海南 ?？?570208)

葛根總黃酮對去卵巢大鼠骨組織γ-氨基丁酸信號通路的影響

朱振標(biāo) 張 壽 沈 慧 林之斌 丁曉莉 劉亦恒

(海口市人民醫(yī)院骨科中心，海南 ?？?570208)

目的觀察葛根總黃酮對去卵巢大鼠骨組織γ-氨基丁酸(GABA)信號通路的影響。方法選用雌性大鼠45只，分為假手術(shù)組15只和手術(shù)組30只，手術(shù)組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，造模12 w時測定骨密度(BMD)，確認(rèn)骨質(zhì)疏松(OP)復(fù)制成功后，將手術(shù)組大鼠又隨機分為模型組和葛根總黃酮組，每組均15只；葛根總黃酮組大鼠給予葛根總黃酮灌胃，持續(xù)時間為12 w，模型組和假手術(shù)組同時給予等量生理鹽水灌胃；實驗結(jié)束后測定大鼠的BMD，ELISA法觀察血清谷氨酸脫羥酶(GAD)水平，免疫組化法觀察股骨遠(yuǎn)端GABA、GABA受體(GABABR)1和GABA轉(zhuǎn)運蛋白(GAT)1的表達(dá)，RT-PCR法檢測股骨GABABR1 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果在造模12 w時，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠第5、6腰椎、肱骨近側(cè)干骺端、股骨近側(cè)干骺端、股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端的骨組織BMD值出現(xiàn)了下降(P<0.05)；給藥結(jié)束后，與模型組相比較，假手術(shù)組和葛根總黃酮組大鼠血清GAD水平、股骨GABA、GABABR1的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；給藥結(jié)束后，與模型組比較，假手術(shù)組和葛根異黃酮組大鼠股骨GABABR1 mRNA表達(dá)均降低(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論葛根總黃酮防治OP的機制之一可能是通過降低血清GAD水平、減少股骨GABA和GABABR1含量及GABABR1 mRNA表達(dá)實現(xiàn)的。

葛根總黃酮；骨質(zhì)疏松；γ-氨基丁酸信號

骨質(zhì)疏松(OP)發(fā)病中，女性明顯高于男性〔1～3〕，這是因為絕經(jīng)后雌激素水平降低是導(dǎo)致女性發(fā)病的主要原因。防治絕經(jīng)后OP的主要方法是雌激素替代療法，但臨床中發(fā)現(xiàn)其容易引起癌變及其他副作用。植物雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素非常相似，可發(fā)揮擬雌激素或抗激素效應(yīng)。葛根總黃酮是葛根的主要有效成分，具有類似于植物雌激素的作用，且毒副作用低微，可作為雌激素的替代品長期服用，避免了雌激素的致癌作用。本實驗觀察葛根總黃酮對去卵巢大鼠骨組織γ-氨基丁酸(GABA)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用清潔級、3月齡、雌性SD大鼠，共45只，體重(180±20)g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司〔許可證號：SCXK(湘)2009-0012〕。

1.2主要實驗藥物及試劑 葛根總黃酮粉(有效成分含量為40%)；GABA受體(GABABR)1多克隆抗體(英國Abcam公司生產(chǎn))；谷氨酸脫氫酶(GAD)ELISA試劑盒(美國R&D公司生產(chǎn))；免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；GABA轉(zhuǎn)運蛋白(GAT1)多克隆抗體(英國Abcam公司生產(chǎn))；GABA多克隆抗體；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物公司生產(chǎn))；RT-PCR檢測試劑盒(大連寶生物有限公司生產(chǎn))。

1.3主要實驗儀器及設(shè)備 雙能X線骨密度儀(美國Lunar公司，Prodigy型)；高速冷凍離心機(2-16K，德國Sigma公司)；顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀(680型，美國BIO-RAD公司)；梯度PCR儀(Veriti 96-Well，美國ABI公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司，GELEQ)；電子天平(ACS-3C型，廣州中山市新和基科技開發(fā)有限公司生產(chǎn))。

1.4實驗方法

1.4.1實驗分組 大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用自來水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后按隨機數(shù)字表法將45只大鼠隨機分為假手術(shù)組15只、手術(shù)組30只。假手術(shù)組大鼠行腹腔手術(shù)找到卵巢，但不切除，手術(shù)組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。所有動物飼養(yǎng)12 w后檢測骨密度(BMD)，以確定OP動物模型復(fù)制成功是否，若成功后即將30只手術(shù)組大鼠再隨機分為模型組、葛根總黃酮組各15只。

1.4.2制作OP模型 OP模型制作參照文獻(xiàn)中的方法〔4〕，切除雙側(cè)卵巢制作大鼠OP模型。將稱重后的各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg，行全身麻醉后取仰臥位，固定后進(jìn)行腹部剃毛并消毒，沿下腹部正中腹白線作縱行切口(切口長度2～3 cm)，打開腹腔后即切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后切口用75%酒精棉球消毒。假手術(shù)組亦打開腹腔，但不切除卵巢。術(shù)后為預(yù)防感染各組大鼠腹腔注射10萬U青霉素3 ml/只，1次/d，連續(xù)3 d。

1.4.3BMD測定 術(shù)后第12周，手術(shù)組和假手術(shù)組大鼠行全身麻醉后測定BMD。測定部位為第5、6腰椎、肱骨近側(cè)干骺端、股骨近側(cè)干骺端、股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端。股骨近側(cè)干骺端為股骨近側(cè)1/4，肱骨近側(cè)干骺端為肱骨近側(cè)1/4，股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端為股骨遠(yuǎn)側(cè)1/4。

1.4.4給藥方法 模型復(fù)制成功后，給藥組大鼠用葛根總黃酮灌胃50 mg·kg-1·d-1。將藥物稀釋成1.0 ml/100 g，體重5 mg/ml后即進(jìn)行灌胃，1次/d(灌胃前12 h應(yīng)禁食不禁水，持續(xù)12 w)。同時假手術(shù)組和模型組用等量生理鹽水灌胃。

1.4.5標(biāo)本采集 灌胃12 w后處死大鼠，腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg，心臟采血，離心后取血清，置-20℃?zhèn)溆?。再依次灌注生理鹽水200～250 ml、4%多聚甲醛350～400 ml。灌注完以上液體即取左側(cè)股骨，用DEPC水處理后，密封包裹保存于液氮中；取出右側(cè)股骨，在4℃條件下用4%多聚甲醛中固定24 h。

1.4.6血清GAD含量測定 ELISA法按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.7免疫組化法檢測GABA、GABABR1和GAT1 按試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用Image-ProPlus6.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析〔5〕，測量免疫陽性部位的平均光密度。

1.4.8RT-PCR法檢測GABABR1 mRNA的表達(dá) 引物的設(shè)計以GAPDH為對照，大連寶生物有限公司合成,RT-PCR方法見參考文獻(xiàn)〔6〕。GAPDH上游5'-ACCACAGTCCAIGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'；GABABR1上游5'-AGCTGACCAGACCTTGGTCAT-3'，下游5'-AACTGGCTTCTCCCTATGTGTGG-3'。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊時采用Tukey檢驗，方差不齊時采用DulmettT3檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 實驗結(jié)束時可能由于手術(shù)、麻醉等原因，一部分大鼠出現(xiàn)死亡，死亡分布情況為：假手術(shù)組大鼠死亡1只；模型組死亡2只；葛根總黃酮組死亡1只。給藥一段時間后，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠體態(tài)臃腫，皮毛發(fā)黃，欠光澤，反應(yīng)遲緩，而假手術(shù)組和葛根總黃酮組大鼠則皮毛光澤，反應(yīng)敏捷。

2.2各組大鼠不同部位BMD測定 手術(shù)12 w后，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠全身多個部位出現(xiàn)BMD降低。其中左股骨遠(yuǎn)端和右肱骨近端、右股骨遠(yuǎn)端、5～6腰椎、右股骨近端、左股骨近端等部位BMD值差異顯著(P<0.05，P<0.01)，說明手術(shù)組大鼠骨量明顯丟失，提示OP模型復(fù)制成功，見表1。

2.3各組大鼠血清GAD表達(dá) 給藥結(jié)束后，和模型組大鼠比較〔(33.01±5.08)pmol/L〕，假手術(shù)組〔(22.88±4.32)pmol/L〕和葛根總黃酮組〔(21.36±4.45)pmol/L〕大鼠血清中GAD值均顯著增高(P<0.05)，假手術(shù)組、葛根總黃酮組GAD值比較無差異(P>0.05)。

表1 手術(shù)12 w時各組各部位BMD水平比較(±s，g/cm2，n=14)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01，2)P<0.05

2.4骨組織GABA、GABABR1、GAT1的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，與模型組比較，假手術(shù)組和葛根總黃酮組大鼠骨組織GABA、GABABR1平均光密度均降低(P<0.05)，但假手術(shù)組和葛根總黃酮組之間骨組織GABA、GABABR1平均光密度比較無差異(P>0.05)。與模型組比較，假手術(shù)組和葛根總黃酮組大鼠骨組織GAT1的平均光密度均降低，但無顯著差異(P>0.05)，假手術(shù)組和葛根總黃酮組之間亦無差異(P>0.05)，見表2。

2.5骨組織GABABR1 mRNA表達(dá) RT-PCR檢測表明，與模型組(0.750 3±0.031)大鼠比較，假手術(shù)組骨組織GABABR1 mRNA的表達(dá)顯著降低(0.623 2±0.036，P<0.01)，葛根總黃酮組大鼠骨組織GABABR1 mRNA的表達(dá)亦降低(0.678 1±0.044，P<0.05)，但假手術(shù)組和葛根總黃酮組兩者之間無差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠骨組織GABA、GABABR1、GAT1蛋白含量平均光密度比較(±s)

與模型組比較:1)P<0.05

3 討 論

GABA信號通路由谷氨酸、GAD、GABA-T、GABA、GABAR、GAT等組成〔7，8〕。GABA是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富和功能最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，以GABA為遞質(zhì)的中樞突觸部位約占50%，GABA在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，參與多種神經(jīng)生理活動，已報道其具有調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)腦部血流、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、預(yù)防肥胖、促進(jìn)乙醇代謝、改善更年期綜合征等生理活性〔9～11〕。有學(xué)者等〔9〕通過研究有如下發(fā)現(xiàn)：①GABA能促進(jìn)生長激素(GH)分泌，而生長激素具有促進(jìn)軟骨、骨骼、肌肉結(jié)締組織增長、促進(jìn)身體許多組織RNA及蛋白質(zhì)合成的作用。②GH具有增加軟骨中膠原和硫酸軟骨素、其他蛋白質(zhì)、核酸合成，促進(jìn)肝臟等組織合成胰島素生長因子(IGF)的作用。IGF是骨組織中含量較豐富的生長因子，它能刺激成骨細(xì)胞(OB)增殖、分化，增殖前體成骨，增多功能性O(shè)B的數(shù)目等。

OP的臨床表現(xiàn)主要為患者骨量明顯下降，易發(fā)骨折，同時可能還伴有嚴(yán)重的骨痛，其主要是由骨重建高轉(zhuǎn)換而引起的。女性絕經(jīng)后出現(xiàn)明顯的OP多由于缺乏雌激素而引起骨重建高轉(zhuǎn)換的。本實驗結(jié)果說明了OP模型大鼠骨組織內(nèi)GABA信號處于一種高表達(dá)水平，由于模型組大鼠骨量嚴(yán)重丟失，由此推斷GABA信號的高表達(dá)是為了對抗骨量的丟失。而葛根總黃酮可以較好地治療OP，使OP模型大鼠的骨量增加，降低了成骨的迫切性，使神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用減緩，減少了GABA及相關(guān)物質(zhì)的釋放。推測當(dāng)GABA在身體內(nèi)大量聚集但又不能及時被轉(zhuǎn)運的情況下，GABA可能是通過GABABR抑制葛根總黃酮或許能夠通過GABA抑制OB活性這種途徑治療OP，這可能是葛根異黃酮治療OP的機制之一。

1鄭 青,梁 寧.老年性骨質(zhì)疏松患者血清細(xì)胞因子水平與 OPG/RANKL/RANK 軸的相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2012;32(17):3651-3.

2褚建國,王季軍.骨質(zhì)疏松骨代謝的 OPG/RANKL/RANK 作用機制〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(10):5015-7.

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8劉志廣.腺苷A1受體在癲癇發(fā)病機制中的作用及其與GABA信號通路相關(guān)性的研究〔D〕.武漢：華中科技大學(xué),2013.

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11趙 暉,王 蕾,張秋霞,等.竹節(jié)參總皂苷對血管癡呆大鼠遞質(zhì)氨基酸及自由基代謝的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2010;30(11):3096-8.

〔2015-08-29修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

海南省自然科學(xué)基金(No.811156)；海南省衛(wèi)生廳資助項目(No.瓊衛(wèi)2010-69)

劉亦恒(1976-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事骨質(zhì)疏松及脊柱脊髓損傷研究。

朱振標(biāo)(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨質(zhì)疏松及骨關(guān)節(jié)疾病研究。

R28

A

1005-9202(2017)16-3940-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.014