高 寒 王瑛堅(jiān)

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

程序性死亡因子4在宮頸鱗癌中的表達(dá)及其生物學(xué)意義

高 寒 王瑛堅(jiān)1

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

目的探討程序性死亡因子(PDCD)4蛋白在子宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及其生物學(xué)意義。方法采用免疫組織化學(xué)(SP)法及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)16例正常子宮頸組織和70例子宮頸鱗癌組織中PDCD4的表達(dá)情況，并分析其與宮頸鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系。結(jié)果PDCD4在正常子宮頸組織、子宮頸鱗癌組織中的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；子宮頸鱗癌組織中PDCD4表達(dá)下降，與子宮頸鱗癌的分化程度及分期相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論P(yáng)DCD4在子宮頸鱗癌組織中異常表達(dá)與子宮頸鱗癌發(fā)生及惡性程度密切相關(guān)，檢測(cè)其在癌組織中的表達(dá)水平對(duì)子宮頸鱗癌病理診斷、預(yù)后具有重要意義。

宮頸鱗癌；程序性死亡因子4；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

近年來(lái)，子宮頸鱗癌的發(fā)病率與死亡率都呈明顯上升趨勢(shì)，其機(jī)制尚不清楚〔1〕。有研究認(rèn)為，子宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與宮頸組織細(xì)胞增殖及凋亡的失衡密切相關(guān)〔2〕。程序性細(xì)胞死亡因子(PDCD)4作為凋亡調(diào)控分子，通過(guò)抑制核糖體復(fù)合物形成及蛋白質(zhì)合成，從而影響細(xì)胞周期及凋亡〔3〕。最近研究表明，PDCD4作為新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、腸癌、鼻咽癌等多種人腫瘤組織中表達(dá)缺失或低表達(dá)〔4〕。目前，PDCD4與子宮頸癌之間的關(guān)系國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在探討子宮頸鱗癌中PDCD4的表達(dá)及其與分化程度和病理分期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 收集吉林省2003～2015年經(jīng)病理學(xué)檢查確診的子宮肌瘤和子宮頸癌手術(shù)切除標(biāo)本86例，其中子宮頸癌70 例(組織學(xué)類(lèi)型均為鱗癌)，16 例因子宮肌瘤切除的正常子宮頸上皮組織作為對(duì)照。70例子宮頸鱗癌按病理學(xué)分化程度分為高分化24例，中分化21例，低分化25例?；颊吣挲g32～76 歲，中位年齡54歲。每例標(biāo)本術(shù)前均未接受化療和放療等抗腫瘤治療。

1.2檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)(SP)法及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，檢測(cè)16例正常子宮頸和70例子宮頸鱗癌組織中PDCD4的表達(dá)。所用兔PDCD4多克隆抗體工作濃度均為1∶200。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照SP法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)及RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3結(jié)果判定

1.3.1SP法檢測(cè)結(jié)果判定 當(dāng)觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃褐色或棕黃色顆粒時(shí)表示PDCD4蛋白陽(yáng)性表達(dá)，主要以細(xì)胞質(zhì)及核周為主。觀察染色，在高倍顯微鏡下(400倍)觀察并隨機(jī)選取每張切片中3～5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性率進(jìn)行評(píng)分判定。將PDCD4表達(dá)強(qiáng)度分為：陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、陽(yáng)性()、強(qiáng)陽(yáng)性()。(1)染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色計(jì)0分，染色弱染為淺黃色計(jì)1分，染色較強(qiáng)染為棕黃色計(jì)2分；染色強(qiáng)染為黃褐色計(jì)3分。(2)陽(yáng)性率計(jì)分：未觀察到陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞率<10%為陰性(-)計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞率11%～30%計(jì)1分，31%～60%計(jì)2分，>60%計(jì)3分。計(jì)算兩種分值和，相加分值≥3分為陽(yáng)性〔5〕。

1.3.2RT-PCR檢測(cè)結(jié)果判定 將PCR圖像輸入上海天能凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度的分析，對(duì)照Marker，PDCD4 mRNA陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)在PDCD4相應(yīng)位置248 bp處出現(xiàn)特異性條帶，陰性表達(dá)則是在對(duì)應(yīng)區(qū)域未出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。GAPDH長(zhǎng)度為616 bp。以 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定特異性片段。PDCD4 mRNA表達(dá)的相對(duì)含量測(cè)定是利用內(nèi)參照GAPDH光密度值標(biāo)化PDCD4 mRNA的吸光度值得到，即PDCD4相對(duì)含量=(PDCD4光密度值/GAPDH光密度值)×100。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SP法檢測(cè)結(jié)果 所有樣本染色特異性均良好，觀察發(fā)現(xiàn)在正常宮頸組織中PDCD4陽(yáng)性顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)及核周，以鱗狀上皮的基底細(xì)胞、棘細(xì)胞為主，呈棕黃色或黃褐色顆粒；而PDCD4陽(yáng)性顆粒在宮頸鱗癌組織細(xì)胞質(zhì)中也可見(jiàn)，并且會(huì)隨著宮頸鱗癌分化程度的降低逐漸減少，具體表現(xiàn)為高分化宮頸鱗癌組織中PDCD4表達(dá)可為甚至，以細(xì)胞質(zhì)為主；中分化表達(dá)主要為+；而低分化表達(dá)為+或者-。PDCD4在宮頸鱗癌中-50例，+11例，5例，4例；在正常宮頸組織PDCD4陽(yáng)性率(87.50%，+2例，4例，8例)和高分化宮頸鱗癌組織中陽(yáng)性率〔16例(66.67%)〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在中分化、低分化的宮頸鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)〔3例(14.28%)，1例(4.00%)〕越來(lái)越低，與正常宮頸組織相比較差異顯著(P<0.01)。

圖1 PDCD4在正常子宮頸上皮細(xì)胞、高、中、低分化宮頸鱗癌中的表達(dá)(SP，×400)

2.2RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 16例正常宮頸組織中有14例(87.5%)、70例宮頸鱗癌組織中有20例(28.57%)擴(kuò)增出特異性片段。PDCD4 mRNA在正常宮頸組織、高分化、中分化及低分化宮頸鱗癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度分別為(1.734±0.279)、(2.161±0.468)、(1.154±0.184)和(0.626±0.231)。PDCD4 mRNA在高分化宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在中、低分化宮頸鱗癌組織中的表達(dá)與正常宮頸組織比較均有顯著差異(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

M：DL 2 000 marker 1:正常宮頸；2:高分化宮頸鱗癌；3：中分化宮頸鱗癌；4：低分化宮頸鱗癌圖2 PDCD4 mRNA在正常宮頸、宮頸鱗癌組織中的表達(dá)

3 討 論

子宮頸癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與基因異常表達(dá)有關(guān)，是一個(gè)涉及多基因、復(fù)雜的演變過(guò)程〔6〕，如基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)異常、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變等都可以導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，從而引起惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前研究認(rèn)為癌基因、抑癌基因及凋亡基因的異常改變，是宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔7〕。

PDCD4是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，位于人類(lèi)染色體10q24，PDCD4作為凋亡調(diào)控分子，通過(guò)抑制核糖體復(fù)合物形成及蛋白質(zhì)合成，從而影響細(xì)胞周期及凋亡。最近研究表明，PDCD4作為新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、腸癌、鼻咽癌等多種人腫瘤組織中表達(dá)缺失或低表達(dá)〔4,8〕，而PDCD4的缺失或低表達(dá)嚴(yán)重影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，造成腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖，從而促進(jìn)乳腺癌、肺癌、腸癌、鼻咽癌等癌癥的發(fā)展，加快患者病情的惡化。另外，研究發(fā)現(xiàn)PDCD4也可抑制C-JUN末端的磷酸化繼而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移〔9〕，C-JUN信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、遷移侵襲轉(zhuǎn)移都有關(guān)聯(lián)，PDCD4通過(guò)抑制C-JUN分子磷酸化，從而阻滯C-JUN信號(hào)通路傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖與遷移侵襲。

本研究結(jié)果提示PDCD4低表達(dá)或表達(dá)缺失與宮頸鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)，PDCD4在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平與宮頸鱗癌的分化程度有關(guān)，分化程度越低，PDCD4表達(dá)水平越低甚至缺失，PDCD4可以影響宮頸鱗癌的發(fā)展過(guò)程。

1胡尚英,鄭榮壽,趙方輝，等.1989至2008年中國(guó)女性子宮頸癌發(fā)病和死亡趨勢(shì)分析〔J〕.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2014;36(2):119-25.

2Prakash P,Patne SC,Singh AK,etal.PCR and genotyping for HPV in cervical cancer patients〔J〕.J Glob Infect Dis,2016;8(3):100-7.

3高 寒.PDCD4、MMP-14在宮頸鱗癌中的表達(dá)及其生物學(xué)意義〔D〕.長(zhǎng)春：吉林大學(xué),2010.

4Schmid T,Blees JS,Bajer MM,etal.Diaryl disulfides as novel stabilizers of tumor suppressor pdcd4〔J〕.PLoS One,2016;11(3):e0151643.

5Wang Y,Guan S,Zhao G,etal.Expressions of aquaporin-4,matrix metallo-proteinase-2 and matrix metallo-proteinase-14 in peritumor edematous zone of glioma and clinical implications〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2014;94(29):2290-2.

6De Marchi T,Liu NQ,Stingl C,etal.4-protein signature predicting tamoxifen treatment outcome in recurrent breast cancer〔J〕.Mol Oncol,2016;10(1):24-39.

7Mallmann P,Mallmann C.Neoadjuvant and adjuvant chemotherapy of cervical cancer〔J〕.Oncol Res Treat,2016;39(9):522-4.

8Biyanee A,Singh P,Klempnauer KH.Translation,PDCD4 and eIF4A〔J〕.Oncoscience,2015;2(9):731-2.

9Cho JH,Kim YW,Choi BY,etal.Sulforaphane inhibition of TPA-mediated PDCD4 downregulation contributes to suppression of c-Jun and induction of p21-dependent Nrf2 expression〔J〕.Eur J Pharmacol,2014;741:247-53.

〔2017-01-05修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.20140414018GH)

王瑛堅(jiān)(1970-)，女，副教授，主要從事婦科腫瘤臨床研究。

高 寒(1975-)，女，碩士，副教授，主要從事病理學(xué)與病理生理學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3934-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.011

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院