代 淵 任 波 陳 歡 魏江平 任香怡 付文君 徐世軍

(成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，四川 成都 611137)

膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒作用的拮抗效應(yīng)及機制

代 淵 任 波1，2陳 歡1，2魏江平1，2任香怡1，2付文君1，2徐世軍1，2

(成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，四川 成都 611137)

目的觀察膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒作用的拮抗效應(yīng)及機制。方法采用大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型，觀察膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒率的影響；采用免疫組織化學(xué)法觀察膚樂顆粒對顱骨Syk、Fyn和COX-2表達的影響。結(jié)果膚樂顆粒高、中、低劑量組大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒率顯著低于模型組(P<0.05)；膚樂顆粒高劑量組顱骨Syk較模型組顯著降低(P<0.05)；膚樂顆粒高、中劑量組顱骨Fyn較模型組顯著降低(P<0.05)；膚樂顆粒高、中、低劑量組顱骨COX-2較模型組顯著降低(P<0.05)。結(jié)論膚樂顆粒具有良好的抗過敏作用，其機制與抑制Src家族非受體蛋白酪氨酸激酶激活有關(guān)。

膚樂顆粒；抗過敏；Syk；Fyn；COX-2

老年皮膚瘙癢癥至今發(fā)病機制不明，一般認(rèn)為與老年人性腺功能低下，皮脂腺和汗腺分泌功能減退，皮膚干燥和退行性萎縮有關(guān)。研究表明過敏因素是老年皮膚瘙癢癥誘發(fā)和加重的主要因素之一，而Src家族非受體蛋白酪氨酸激酶磷酸化激活在IgE介導(dǎo)的肥大細胞脫顆粒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通路具有重要的作用。中醫(yī)認(rèn)為本病屬于“風(fēng)癢”、“癢風(fēng)”、“血風(fēng)瘡”、“谷道癢”等范疇，病機主要責(zé)之于血燥生風(fēng)，膚樂顆粒由制首烏、白鮮皮、赤芍、當(dāng)歸等7味中藥組成的專利處方，具有滋陰潤燥，養(yǎng)血祛風(fēng)的功效，臨床適用于老年皮膚瘙癢癥，癥見皮膚干燥瘙癢或肌膚灼熱、情緒煩躁或入夜尤甚或(及)此起彼伏，舌紅苔少或干，脈弦細或弦細數(shù)。本研究對膚樂顆粒抑制肥大細胞脫顆粒作用及機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑 膚樂顆粒(1.67 g原生藥/g)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制與制劑系提供，批號：140715；馬來酸氯苯那敏片(撲爾敏)，太極西南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：120308。卵白蛋白，Sigma產(chǎn)品；百白破疫苗，武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，批號：20131047-2。甲苯胺藍(進口分裝)，批號：120418，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。Syk一抗，兔多克隆抗體，批號：bs-0685R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Fyn一抗，兔多克隆抗體，批號：bs-13236R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；COX-2一抗，兔多克隆抗體，批號：bs-0732R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗動物 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，SPF級，成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號為：SCXK(川)2013-24。

1.3試驗儀器 轉(zhuǎn)輪式切片機(徠卡-2016，德國)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；圖像分析軟件Motic Images Advanced。

1.4抗血清制備 取(100±10)g雄性SD大鼠5只，兩后肢肌肉注射1%卵白蛋白溶液0.5 ml/只，同時腹腔注射百白破疫苗0.5 ml/只，隔日重復(fù)致敏一次，共3次。末次致敏13 d后大鼠腹主動脈取血，3 500 r/min，離心10 min，分離血清并合并，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5分組及給藥方法 另取SD大鼠60只，體重(200±20)g，按體質(zhì)量隨機分為空白對照組、模型對照組、馬來酸氯苯那敏片組(撲爾敏，5 mg/kg)、膚樂顆粒高(14 g原生藥/kg)、中(7 g原生藥/kg)、低(3.5 g原生藥/kg)劑量組，每組10只，給藥，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)6 d。給藥第4天大鼠頭部皮下注射抗血清0.1 ml/只致敏，注射48 h后各組大鼠尾靜脈注射用0.5%伊文思藍溶液配成2 mg/ml的卵白蛋白溶液攻擊，注射量10 ml/kg。30 min后斷頭處死大鼠。

1.6顱骨肥大細胞脫顆粒觀察 常規(guī)方法制備顱骨膜骨切片，切片脫蠟復(fù)水后在甲苯胺藍溶液染色30 s，蒸餾水洗2次，每次3～5 min，30%酒精分色，在鏡下控制分色時間，以肥大細胞異染顆粒呈紫色為宜。每只大鼠切片選取3個400倍視野，計數(shù)肥大細胞總數(shù)和脫顆粒數(shù)目(包膜出現(xiàn)明顯破裂或有顆粒外逸為脫顆粒)，將相應(yīng)數(shù)值平均即為該點400倍鏡下局部肥大總數(shù)和脫顆粒數(shù)目。按下式計算肥大細胞脫顆粒率：脫顆粒率(%)=肥大細胞脫顆粒數(shù)目/肥大細胞數(shù)×100%。

1.7免疫組化法檢測顱骨Syk、Fyn和COX-2表達 采用S-P 法進行免疫組化操作。大鼠顱骨常規(guī)制片、脫蠟后滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)抗原后滴加山羊血清封閉，滴加稀釋的一抗(1∶200)4℃過夜，PBS(pH 7.2～7.4)洗3次后滴加二抗封閉，DAB顯色后蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，每例標(biāo)本測3張切片，每張切片的每個測定部位隨機選取三個視野，取平均值。所有平均光密度(IA)值測定均在相同的光學(xué)條件下完成。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行One-way ANOVA結(jié)合Post Hoc檢驗。

2 結(jié) 果

2.1膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒的影響 大鼠顱骨切片鏡下背景為淡藍色或無色，肥大細胞胞質(zhì)呈藍色，胞核為無色，肥大細胞多在硬腦膜血管周圍分布，少數(shù)大鼠硬腦膜血管周圍胞質(zhì)中可見粗大的藍紫色或紫紅色顆粒；模型組切片背景色與空白對照組一致，每只大鼠硬腦膜血管周圍可見大量脫顆粒的肥大細胞，分布面廣、密集，平均光密度值較空白對照組顯著增高(P<0.01)；撲爾敏組染色較模型組淺，分布面積小且分散，平均光密度較模型組顯著降低(P<0.05)，膚樂顆粒高、中、低劑量組染色較模型組淺，每只大鼠硬腦膜血管周圍可見少量脫顆粒的肥大細胞，分布面積小而分散，平均光密度值較模型組顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型顱骨Syk表達的影響 Syk主要分布在細胞膜，成淺黃色或棕黃色顆粒見圖2。模型組大鼠顱骨Syk較空白對照組顯著高表達，著色較深，平均光密度值顯著增高(P<0.01)。撲爾敏組Syk較模型組顯著低表達，平均光密度顯著降低(P<0.05)。膚樂顆粒高劑量組Syk較模型組顯著低表達，著色較淺，平均光密度值亦顯著降低(P<0.05)，膚樂顆粒中、低劑量有下降趨勢。見表1。

圖1 各組大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒的比較(甲苯胺藍染色 ，×400)

圖2 各組顱骨Syk表達(DAB,×400)

2.3膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型腦膜顱骨Fyn表達的影響 Fyn主要分布在細胞膜，成淺黃色或棕黃色顆粒。模型組大鼠顱骨Fyn較空白對照組顯著高表達，分布面積較廣，著色較深，平均光密度值顯著增高(P<0.01)。撲爾敏組Fyn較模型組顯著低表達，平均光密度顯著降低(P<0.05)。膚樂顆粒高、中劑量組Fyn較模型組顯著低表達，分布面積較窄，著色較淺，平均光密度值亦顯著降低(P<0.05)，膚樂顆粒低劑量組Fyn有下降趨勢，見圖3，表1。

2.4膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型腦膜顱骨COX-2表達的影響 COX-2主要分布在細胞質(zhì)、核膜或間質(zhì)，成淺黃色或棕黃色顆粒見圖4。模型組大鼠顱骨COX-2較空白對照組顯著高表達，分布面積較廣，著色較深，分布比較集中，平均光密度值顯著增高(P<0.01)，撲爾敏組較模型組COX-2顯著低表達，平均光密度顯著降低(P<0.05)。膚樂顆粒高、中、低劑量組COX-2較模型組顯著低表達，分布面積較窄，著色較淺，平均光密度值亦顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖3 各組顱骨Fyn表達(DAB,×400)

圖4 各組顱骨COX-2表達(DAB,×400)

組別脫顆粒率(%)SykFynCOX?2空白對照組6．36±7．792)0．303±0．0192)0．310±0．0132)0．284±0．0052)模型組49．41±3．000．329±0．0100．341±0．0170．331±0．022撲爾敏組29．07±6．132)0．304±0．0142)0．325±0．0151)0．288±0．0082)膚樂顆粒高劑量組23．93±7．652)0．309±0．0181)0．320±0．0132)0．289±0．0072)膚樂顆粒中劑量組28．70±5．422)0．314±0．0110．326±0．0161)0．303±0．0092)膚樂顆粒低劑量組43．16±5．941)0．313±0．0130．339±0．0170．297±0．0052)

與模型組比較：1)P<0.05,P<0.01

3 討 論

老年皮膚瘙癢癥臨床患病率高達40.7%〔1〕，其發(fā)病與過敏原尤其是與吸入性過敏原有關(guān)〔2〕。肥大細胞作為過敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞，其脫顆粒釋放過敏性介質(zhì)是導(dǎo)致過敏效應(yīng)放大的關(guān)鍵機制。IgE介導(dǎo)的信號途徑、酪氬酸激酶(Lyn)依賴的激活途徑和Fyn依賴的激活途徑是三條肥大細胞脫顆粒的關(guān)鍵途徑〔3〕。肥大細胞表面具有高親和力IgE受體FcεRⅠ，可通過非IgE依賴的非免疫性激活和IgE依賴的免疫激活兩種方式激活。研究表明酪氨酸激酶Lyn是FcεRⅠ交聯(lián)后第一個被激活的激酶，Lyn激活之后通過磷酸化γ-I-TAMs激活Syk〔4〕。因此認(rèn)為Lyn、Syk是細胞活化脫顆粒IgE/FcεRⅠ介導(dǎo)的信號通路的源頭按鈕，Lyn和Syk的激活可進一步激活下游多條信號通路，引起胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的合成與釋放，最終導(dǎo)致細胞活化脫顆粒。此外，受體的聚集交聯(lián)之后亦可激活Fyn，進而激活Fyn依賴的Gab2，激活的Gab2隨后引起磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶C(PKC)的活化〔5〕，通過激活下游通路引起過敏介質(zhì)的合成和釋放。研究表明即使在FcεRI，Syk，LAT和ERK2仍然發(fā)生磷酸化的情況下，F(xiàn)yn 的缺失會破壞PIP3 的活化和肥大細胞的脫顆粒〔5〕。由此可見，Src 家族非受體蛋白酪氨酸激酶(PTKs)Syk和Fyn在肥大細胞脫顆粒信號途徑中扮演著細胞信號中轉(zhuǎn)和下游“放大器”的角色。此外，在Lyn-Syk 激酶依賴的肥大細胞脫顆粒信號途徑過程中，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物也被激活，調(diào)節(jié)MAPK和PLA2〔6〕。一旦PLA2 激活便轉(zhuǎn)位至細胞膜，肥大細胞繼而釋放花生四烯酸并且募集白三烯和前列腺素。COX-2是花生四烯酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，在前列腺素類介質(zhì)的生成中具有重要作用。本研究結(jié)果說明膚樂顆粒具有拮抗模型大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒的作用，其機制與抑制Src家族非受體蛋白酪氨酸激酶激活和抑制前列腺素類過敏介質(zhì)的生成和釋放有關(guān)。

1彭學(xué)標(biāo).老年人的瘙癢性皮膚病〔J〕.中國皮膚性病學(xué)雜志，2000；14(3)：173-4.

2吳躍申，水潤英，徐琴言，等.老年皮膚瘙癢癥患者血清特異性IgE的檢測分析〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2004；3(2)：89-90.

3李 敏，周 建，蔣春雷.IgE 介導(dǎo)的肥大細胞脫顆粒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究進展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2009；9(18)：3539-42.

4Beavitt SJE，Harder KW，Kemp JM，etal.Lyn-deficient mice develop severe，persistent asthma：Lyn is a critical negative regulator of Th2 immunity〔J〕.J Immunol，2005；175(3)：1867-75.

5Parravicini V，Gadina M，Kovarova M，etal.Fyn kinase initiates complementary signals required for IgE-dependent mast cell degranulation〔J〕.Nature Immunol,2002；3(8)：741-8.

6Hamawy MM，Mergenhagen S，Eand Siraganian R，etal.IgE-dependent mast cell activatidion：protein tyrosine phosphorylation as a mechanism of signaling in mast cells and basophils〔J〕.Cell Signal，1995；7：535-44.

〔2016-04-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

四川省科技支撐項目(No.2014SZ0071-09)；四川省苗子工程項目(No.2014-095)

徐世軍(1975-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

代 淵(1975-)，女，博士，副教授，主要從事中醫(yī)老年性疾病研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)16-3911-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.002

1 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室培育基地

2 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院