陳 瑤 蘇 波 楊 群 任伯緒 劉 洋

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

·基礎(chǔ)研究·

D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁對C57小鼠海馬Bcl2表達的影響

陳 瑤1蘇 波 楊 群 任伯緒 劉 洋

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)

目的探討D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁(AlCl3)對C57小鼠海馬B淋巴細胞瘤-2(Bcl2)表達的影響及在阿爾茨海默病(AD)發(fā)病中的意義。方法D-半乳糖90 mg·kg-1·d-1聯(lián)合AlCl340 mg·kg-1·d-1連續(xù)90 d腹腔注射制造AD小鼠模型；通過比較全腦圖片及糖水實驗初步鑒定模型復制是否成功；免疫組化檢測AD及野生型對照組小鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Bcl2蛋白表達水平。結(jié)果與對照組比較，AD小鼠完整腦組織表面泛白、無血色，血管明顯減少。糖水偏好實驗：與對照組比較，AD組小鼠糖水偏好百分比明顯下降(P<0.01)。與對照組相比，AD小鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Bcl2蛋白陽性表達明顯減少，呈深棕色陽性顆粒數(shù)目明顯減少(CA1、CA3區(qū)P<0.05；DG區(qū)P<0.01)。結(jié)論D-半乳糖聯(lián)合AlCl3通過抑制Bcl2的表達，導致海馬神經(jīng)細胞異常凋亡，進而引起AD的發(fā)生、發(fā)展。

阿爾茨海默?。籅淋巴細胞瘤-2基因；凋亡；海馬

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，是發(fā)生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，是一種慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病〔1〕?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元丟失、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)和老年斑(SP)等為AD的主要病理特征。細胞凋亡信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、衰老退化進程中都起著關(guān)鍵作用。在發(fā)育過程中，為對抗一因多效，細胞凋亡會損傷一些衰老的細胞，利用這種程序性的方式，可以將這些衰老的神經(jīng)細胞移除〔2〕。在成年腦組織中，神經(jīng)元通過抗細胞凋亡保持神經(jīng)突觸的可塑性并維持生存〔3〕。B淋巴細胞瘤-2(Bcl2)屬于抗細胞凋亡家族成員，可以調(diào)節(jié)某些前細胞凋亡因子，如Bax的表達〔4〕。此外，增加Bcl2的表達可以降低Bax表達，抑制凋亡復合體的形成，達到抗細胞凋亡的目的〔5〕。本研究擬觀察D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁(AlCl3)對C57小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)Bcl2表達的影響。

1 材料和方法

1.1材料 清潔級雄性C57小鼠，購于湖北省實驗動物研究中心，動物許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。

1.2方法

1.2.1建立AD小鼠模型 選用清潔級健康雄性C57小鼠，體重15～20 g，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，自由取食飲水，通風良好，室溫22℃～25℃，適應性喂養(yǎng)1 w后隨機分為兩組，每組15只。AD組采用Luo等〔6〕的造模方法腹腔注射D-半乳糖(武漢科瑞生物)90 mg·kg-1·d-1(生理鹽水配制)和AlCl3(天津福晨化學試劑廠)40 mg·kg-1·d-1(生理鹽水配制)溶液，連續(xù)90 d；野生型對照組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2糖水偏好實驗 用糖水和自來水雙瓶給實驗大鼠供飲，通過測量剝奪飲水12 h后大鼠1 h內(nèi)的糖水和自來水消耗量，計算糖水偏好百分比(糖水偏好百分比=糖水消耗量/總液體消耗×100%)。

1.2.3免疫組織化學

1.2.3.1相關(guān)步驟 行為學實驗結(jié)束后，小鼠用10%苯巴比妥(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，打開胸腔，暴露心臟。將注射針頭插入左心室，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，待右心耳處流出澄清液體，換4%多聚甲醛10 ml/min灌注至大鼠四肢強直，然后將小鼠斷頭，快速取出腦組織，置4%多聚甲醛中固定、過夜。常規(guī)石蠟包埋腦組織，約5 μl矢狀切片。切片常規(guī)脫蠟，將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液微波爐加熱至沸騰，3 min×5次。冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.6)洗滌3次。滴加3% H2O2室溫孵育15 min(消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性)，PBS洗3 min×3次。正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，不洗，滴加一抗鼠抗Bcl2抗體(1∶200，A0208，Abclonal公司，美國)，4℃過夜，PBS洗3 min×3次，滴加生物素標記的二抗，37℃孵育20 min，PBS洗3 min ×3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(GK600710，上?；蚩萍脊?顯色，顯微鏡下控制顯色。蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后鏡下觀察蛋白表達，拍照，留存。

1.2.3.2結(jié)果判讀及圖像分析 顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色的物質(zhì)為Bcl2陽性染色。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)，對每例Bcl2免疫組化染色切片的陽性表達顆粒進行定量測量。每張切片放大10×40倍，隨機選取5個視野，測量Bcl-2陽性表達細胞的平均光密度(OD值)。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，計量資料組間比較行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1AD和對照組全腦圖 與對照組比較，AD小鼠完整腦組織表面泛白、無血色，血管明顯減少，表明D-半乳糖聯(lián)合AlCl3已經(jīng)對小鼠的腦組織形成退行性損傷。見圖1。

圖1 AD組和對照組小鼠全腦圖

2.2體重比較和糖水偏好實驗結(jié)果 與對照組〔(24.87±2.21)g〕比較，AD組小鼠的體重〔(20.98±1.65)g〕明顯下降(P<0.05)；與對照組〔(94.38±8.39)η/%〕比較，AD組小鼠糖水偏好百分比〔(56.67±4.46)η/%〕明顯下降(P<0.01)。

2.3免疫組化結(jié)果 與對照組相比，AD小鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Bcl2蛋白陽性表達明顯減少，呈深棕色陽性顆粒數(shù)目明顯減少(P<0.05，P<0.01)。見圖2，表1。

圖2 兩組小鼠各區(qū)Bcl2表達免疫組化結(jié)果(×400)

組別CA1區(qū)CA3區(qū)DG區(qū)對照組6856±10777567±127813458±2353AD組4976±8351)5556±7891)6849±12642)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

Luo等〔6〕的實驗結(jié)果表明，利用D-半乳糖聯(lián)合AlCl3制備AD小鼠模型，AD組小鼠表現(xiàn)為學習記憶減退、皮質(zhì)和海馬區(qū)β淀粉樣蛋白(Aβ)水平增高、Aβ代謝相關(guān)分子表達受影響，可形成NFT、SP等典型的AD癥狀，表明D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導AD小鼠是一種穩(wěn)定的、為國內(nèi)外科研工作者所接受的AD動物模型。最新研究表明，D-半乳糖聯(lián)合AlCl3可造成小鼠海馬區(qū)超氧化物歧化酶(SOD)等的活性下降，導致學習記憶能力降低等AD癥狀的產(chǎn)生〔7〕。神經(jīng)細胞凋亡增加與神經(jīng)退行性病變，如AD等高度正相關(guān)，細胞凋亡是導致學習、記憶退行性病變的機制之一〔8〕。海馬在認知、學習、記憶形成過程中起著重要作用〔9〕。Bcl2在細胞線粒體外膜表面，通過抑制線粒體釋放凋亡誘導因子(AIF)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+等；同時，通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外膜的通透性抗細胞凋亡；此外，Bcl2還可抑制細胞超氧化合物的積累；Bax/Bax同源二聚體可以被Bcl2/Bax異源二聚體競爭性抑制，從而達到抗細胞凋亡的目的〔10〕。Bcl2可能通過維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，抑制促凋亡蛋白的釋放，抑制凋亡蛋白酶的活化及直接抗氧化等抗細胞凋亡〔11〕。

免疫組化檢測結(jié)果提示，D-半乳糖聯(lián)合AlCl3通過抑制抗細胞凋亡因子Bcl2的表達，激活程序性的細胞凋亡信號通路，導致海馬神經(jīng)細胞異常凋亡，進而引起AD的發(fā)生、發(fā)展。

1Magistri M，Velmeshev D,Makhmutova M,etal.Transcriptomics profiling of Alzheimer′s disease reveal neurovascular defects，altered amyloid-beta homeostasis，and deregulated expression of long noncoding RNAs〔J〕.J Alzheimers Dis，2015；48(3)：647-65.

2Ranger AM，Malynn BA，Korsmeyer SJ.Mouse models of cell death〔J〕.Nat Genet，2001；28(2)：113-8.

3Germain M，Slack RS.Dining in with Bcl-2：new guests at the autophagy table〔J〕.Clin Sci (Lond)，2010；118(3)：173-81.

4Cory S，Adams JM.The Bcl2 family：regulators of the cellular life-or-death Switch〔J〕.Nat Rev Cancer，2002；2(9)：647-56.

5Zou H，Li X,Liu X,etal.An APAF-1.cytochrome C multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9〔J〕.J Biol Chem，1999；274(17)：11549-56.

6Luo Y，Niu F,Sun Z,etal.Altered expression of Abeta metabolism-associated molecules from D-galactose/AlCl(3) induced mouse brain〔J〕.Mech Ageing Dev，2009；130(4)：248-52.

7Yang WN，Hu XD,Han H,etal.The effects of valsartan on cognitive deficits induced by aluminum trichloride and D-galactose in mice〔J〕.Neurol Res，2014；36(7)：651-8.

8Zhu X，Raina AK,Perry G,etal.Apoptosis in Alzheimer disease：a mathematical improbability〔J〕.Curr Alzheimer Res，2006；3(4)：393-6.

9Barker GR，Warburton EC.When is the hippocampus involved in recognition memory〔J〕. J Neurosci，2011；31(29)：10721-31.

10Lei X，Chao H,Zhang Z,etal.Neuroprotective effects of quercetin in a mouse model of brain ischemic/reperfusion injury via anti-apoptotic mechanisms based on the Akt pathway〔J〕.Mol Med Rep，2015；12(3)：3688-96.

11Mueller M，Schoeberlein A,Zhou J,etal.Preimplantation factor bolsters neuroprotection via modulating protein kinase A and protein kinase C signaling〔J〕.Cell Death Differ，2015；22(12)：2078-86.

〔2016-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

EffectofD-galactosecombinedwithAlCl3onhippocampalBcl2expressioninC57mice

CHENYao,SUBo,YANGQun,etal.

DepartmentofMedicalFunction,SchoolofMedicine,YangtzeUniversity,Jingzhou434023,Hubei,China

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Bcl2 in Alzheimer's disease (AD) and wild type mice hippocampus.MethodsD-galactose 90 mg·kg-1·d-1and AlCl340 mg·kg-1·d-1continuous intraperitoneal injection of 90 days to make AD mouse model; preliminary appraise AD model by comparing the whole brain images and object recognition experiment. Bcl2 protein expression level was compared in AD and wild type control mice hippocampal CA1, CA3 and DG areas by immunohistochemical detection.ResultsCompared with control group, AD mice brain tissue surface suffused with white color, significantly less blood vessels. The time of AD group used to explore new object was significant less than wild type control group (P<0.01); The discrimination index difference between AD model (10.07±1.33) and wild type control group (33.97±3.74) was very significant. Compared with the wild type control group, the positive expression of Bcl2 protein in hippocampal CA1, CA3 and DG areas were significantly decreased (P<0.05，P<0.01).ConclusionsD-galactose combined with AlCl3could inhibit the expression of Bcl2 resulting in abnormal apoptosis of hippocampal neurons, which could lead to the occurrence and development of AD.

Alzheimer's disease; Bcl2; Apoptosis; Hippocampus

國家自然科學基金青年基金項目(81401095)；湖北省衛(wèi)生計生青年人才項目(WJ2015Q045)；長江大學青年人才基金項目(2015cqr24)

劉 洋(1979-)，男，博士，講師，主要從事神經(jīng)退行性疾病分子機制研究。

陳 瑤(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制研究。

R592

A

1005-9202(2017)16-3909-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.001

1 荊州市中心醫(yī)院