李玉榮，蘇紅田，毛培勝，陳志宏，孔令琪，高洪文

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.全國畜牧總站，北京100125；3.中國農(nóng)業(yè)大學草地所，北京100094）

研究證明多數(shù)種子可通過干燥技術(shù)將含水量（moisture content，MC）安全降至5%～7%以下，種子在常溫下的耐貯性大幅度提高［1］。種子含水量不是越低越好，當脫水到某一閾值以下時，對種子壽命無益，甚至加速種子劣變［2］。超干處理對種子活力的影響取決于種子的耐脫水性，種子耐脫水性是種子發(fā)育過程中獲得的一種綜合特性，與種子類型和發(fā)育階段有關(guān)。種子耐脫水性是判斷種子貯藏特性的重要依據(jù)［3］。

山竹巖黃芪（Hedysarumfruticosum）屬于豆科，富含粗蛋白、氨基酸和粗脂肪，是家畜的優(yōu)質(zhì)飼用半灌木，在天然情況下，山竹巖黃芪種子產(chǎn)量極低且種子質(zhì)量也差，對于山竹巖黃芪種子含水量和種子活力的關(guān)系尚未見報道。本文探討了含水量對山竹巖黃芪種子活力的影響，為山竹巖黃芪種質(zhì)資源的保存提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料是2009年10月收獲的山竹巖黃芪（H.fruticosum）種子，產(chǎn)地赤峰。

1.2 方法

1.2.1 超干處理 室溫硅膠干燥法，得到系列含水量分別為8.01%，4.45%，3.42%，2.65%的山竹巖黃芪種子，其中8.01%含水量的未處理種子作為對照。

1.2.2 老化處理 從系列含水量種子中各分取部分種子用鋁箔袋密封，50℃恒溫箱中處理10d。

1.2.3 回濕處理 試驗前對系列含水量的種子進行回濕處理。將種子放在尼龍網(wǎng)袋中，進行逐級回濕處理。依次置于相對濕度為35%（飽和氯化鈣溶液，20℃），90%（飽和氯化銨溶液，20℃）以及100%（水）相對封閉環(huán)境分別平衡24h。

1.2.4 種子發(fā)芽試驗 采取紙上發(fā)芽，25℃恒溫。30粒/重復，每處理4次重復；每日光照8h，黑暗16 h。前4d每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)，第12d統(tǒng)計正常種苗數(shù)。計算發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和發(fā)芽率。

1.2.5 電導率測定 取大小均勻種子50粒稱重，重復3次。用去離子水洗5次，吸去種子表面浮水，置于100mL的三角瓶中，加去離子水100mL，加蓋后在20℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡24h，用DDS-307型電導儀測定浸出液電導率。

1.2.6 丙二醛含量測定 采用硫代巴比妥酸方法。取萌動種子0.5g，重復3次，8mLTCA研磨至勻漿。3000r·min-1離心10min，吸取上清液2mL（對照加2mL蒸餾水），加入2mL 0.5%硫代巴比妥酸（用10%TCA溶液配制），混勻物在沸水浴反應(yīng)15min，迅速在冰浴中冷卻終止反應(yīng)，4000r·min-1離心15min。取上清在532nm，600nm和450nm波長下測定消光度，計算MDA的濃度。

1.2.7 酶液提取 取0.5g種子，20℃吸漲24h，用8mL 50mmol·L-1PBS（磷酸緩沖液pH7.8），冰浴中研磨勻漿，2000r·min-1離心20min，取上清液即為酶提取液。

1.2.8 過氧化物酶活性測定 在50mL 100mmol·L-1PH6.0磷酸緩沖溶液中加入28μL愈創(chuàng)木酚，加熱攪拌至全部溶解，冷卻后加入30%過氧化氫19μL，混合均勻。取上述反應(yīng)調(diào)配好的混合液3 mL，加入1mL待測樣液，25℃反應(yīng)。對照用3mL反應(yīng)混合液加入1mL樣品研磨緩沖溶液。紫外分光光度計在470nm波長下測定其吸光度值，記錄每隔1min的讀數(shù)，共計3min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.2統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Excel 2003做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超干和老化處理對山竹巖黃種子發(fā)芽生理指標的影響

超干處理不同含水量種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢變化不大（表1），與對照均沒有顯著差異。種子發(fā)芽指數(shù)隨含水量下降而增加，3.42%含水量達到最大，然后又下降。說明適度降低含水量，山竹巖黃芪種子活力增加，含水量繼續(xù)下降到2.65%時，種子發(fā)芽指數(shù)顯著低于4.45%和3.42%含水量的，與對照（8.01%）相比，無顯著差異。

表1 超干和老化處理對山竹巖黃芪種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響Table 1 Effect of ultra-drying and accelerated ageing on germination percentage，germination potential and germination index of H.fruticosu m seeds

老化處理后，不同含水量種子發(fā)芽率均顯著高于對照（表1），發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)隨含水量下降顯著增加，表明超干處理增加了種子的抗老化能力。

2.2 超干和老化處理對種子膜透性的影響

種子發(fā)生劣變時，細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性受到傷害，導致大量細胞內(nèi)物質(zhì)外滲，電導率測定方法提供了一個間接評定質(zhì)膜完整性喪失的方法［4-5］。

超干和老化處理的山竹巖黃芪種子電導率如圖1所示。含水量為4.45%，3.42%的電導率與對照相比沒有顯著差異，含水量為2.65%的電導率顯著高于對照（P＜0.05）。說明適度降低含水量，種子膜系統(tǒng)功能保持良好，過度干燥，當含水量降至2.65%時，種子膜透性顯著增大，對種子已經(jīng)產(chǎn)生了損傷。

種子進行老化處理后，不同含水量種子的電導率與對照相比沒有顯著差異（圖1）。

圖1 超干和老化處理對山竹巖黃芪種子電導率的影響Fig.1 Effect of ultra-drying and accelerated ageing on conductivity of H.fruticosumseeds

2.3 超干和老化處理對種子丙二醛含量的影響

丙二醛是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測定丙二醛的含量被認為可用來衡量脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度量化的方法［6］。

山竹巖黃芪種子超干處理后，含水量為4.45%，3.42%的丙二醛含量與對照相比沒有顯著差異，當含水量繼續(xù)下降，達到2.65%時，丙二醛含量顯著增加（P＜0.05）（圖2）。說明適度超干處理對山竹巖黃芪種子沒有不良影響，過度干燥，當含水量降低至2.65%時，丙二醛積累顯著增加，這與電導率反映的情況一致。

圖2 超干和老化處理對山竹巖黃芪種子丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of ultra-drying and accelerated ageing on malondialdehyde content of H.fruticosumseeds

對不同含水量山竹巖黃芪種子進行老化處理，含水量4.45%種子的丙二醛與對照相比無顯著差異（圖2），含水量為3.42%和2.65%的丙二醛含量之間沒有顯著差異，二者的丙二醛含量均顯著低于含水量為8.01%和4.45%的種子。說明在50℃的高溫條件下，老化過程中含水量為3.42%～2.65%的山竹巖黃芪種子對自由基的攻擊具有較強的自衛(wèi)能力，能有效減弱或阻止脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，抗高溫老化能力強。

2.4 超干和老化處理對山竹巖黃芪種子抗氧化系統(tǒng)酶活性影響

過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是種子抗氧化系統(tǒng)酶中最重要的酶，種子抗氧化系統(tǒng)酶受到破壞或活性的降低是導致種子老化劣變的重要原因［7］。山竹巖黃芪種子超干和老化處理后超氧化物岐化酶活性與對照均沒有顯著差異（表2）。超干處理種子過氧化物酶活性均顯著高于對照（P＜0.05），超干種子（含水量4.45%，3.42%，2.65%）之間沒有顯著差異，老化處理后的過氧化物酶活性隨含水量的減少顯著增加（P＜0.05），含水量為3.42%和2.65%的過氧化物酶活性間沒有顯著差異，均顯著高于4.45%和8.01%的活性（P＜0.05），說明超干種子在老化處理的情況下能更好地保持細胞內(nèi)對活性氧清除的酶系統(tǒng)，超干處理增強了種子的抗老化能力。

表2 超干和老化處理對山竹巖黃芪種子超氧化物岐化酶、過氧化物岐化酶活性的影響Table 2 Effect of ultra-drying and accelerated ageing on SOD and POD activity of H.fruticosumseeds

3 討論與結(jié)論

種子活力是種子質(zhì)量的綜合指標，是種子多種性狀的綜合評價，種子活力是以不同方式表達的，不能用單一的質(zhì)量指標［8］。種子活力及生活力能夠得以保持的基礎(chǔ)是種子細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性，細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定是維持細胞正常生理代謝活動的重要保證，一旦膜系統(tǒng)遭到破壞就會加速種子活力與生活力的喪失。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，他對植物細胞危害很大，丙二醛含量高低變化是衡量種子老化過程中脂質(zhì)過氧化程度的一個重要指標［9］。SOD，POD是重要的活性氧清除酶，從而有效阻止其在體內(nèi)的積累，種子抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞或活性降低都會加劇種子老化。本文采用種子萌發(fā)生理指標、膜透性、脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物、抗氧化系統(tǒng)酶活性等多種方法，評價超干處理對山竹巖黃芪種子活力的影響。結(jié)果表明，隨含水量下降種子活力增強，含水量為3.42%時，種子活力達到最大，含水量繼續(xù)下降至2.65%，種子活力下降，說明過度干燥給種子造成了損傷。

人工老化的方法是測定種子活力的方法之一，通過人工老化的方法還可以預測種子的貯藏能力及種子的抗老化能力。試驗用高溫老化方法測定了種子活力。結(jié)果顯示，不同含水量種子高溫老化后，隨含水量下降種子活力增大，種子抗老化能力顯著增強。試驗結(jié)果表明，種子高溫老化處理后，含水量為2.65%的種子活力最大。換而言之，含水量為2.65%的種子高溫下獲得的老化能力超過因脫水給種子造成的干燥損傷。同時從另一角度說明選擇測定種子活力方法時應(yīng)考慮到溫度這一因素的影響。

Vertucci等［10］的研究表明，超低含水量種子在提高溫度（如65℃）的情況下有較好的活力保持能力，但不等于在室溫條件下此含水量的種子也有如此的活力保持能力。研究種子貯藏最適含水量，應(yīng)明確種子的貯藏溫度才有實際意義［10］。伍曉明［11］等研究顯示油菜（Brassicacampestris）種子在不同溫度條件下有不同的最佳含水量范圍，最佳含水量隨溫度的下降而上升。朱誠等［12］認為洋蔥（Allium cepa）種子貯藏溫度直接影響種子貯藏的最適含水量。

種子超干處理及貯藏過程中種子活力的保持狀況與種子脫水敏感性及其耐干性關(guān)系密切。不同類型種子由于其組分優(yōu)勢內(nèi)貯藏物不同，種子在超干處理以及老化過程中表現(xiàn)的耐干性也有所不同［13］。種子超干貯藏需要確定最低安全含水量，到目前為止還沒有一個通用而簡單易行的方法，準確測定不同種子類型的安全含水量低限值［1］。最低安全水分的高低與種子化學成分組成密切相關(guān)［14］。油料種子可忍耐極度脫水［15-16］，淀粉類種子很難干燥到5%以下［17］，蛋白質(zhì)類種子耐脫水能力在不同品種間存在很大差異。本試驗中，山竹巖黃芪種子屬于豆科蛋白質(zhì)類種子，脫水至3.42%不會影響種子活力，至于種子貯藏的最適含水量的確定尚需根據(jù)貯藏溫度進一步研究。