韓 瑞 仇福成 李培培 王文婷 顧 平
(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 石家莊 051000)
血管性癡呆模型小鼠海馬神經(jīng)元的電生理改變
韓 瑞 仇福成 李培培1王文婷 顧 平
(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 石家莊 051000)
目的觀察血管性癡呆(VD)發(fā)病過程中神經(jīng)元的電生理改變。方法應(yīng)用被動逃避反應(yīng)實驗、神經(jīng)元硫堇染色技術(shù)、膜片鉗操作技術(shù),對實驗動物的認(rèn)知功能及動物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和密度進(jìn)行評價,進(jìn)而觀察神經(jīng)元的興奮性。結(jié)果與假手術(shù)組小鼠相比,模型組小鼠被動逃避反應(yīng)實驗成績明顯下降,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度未見明顯改變,而海馬神經(jīng)元的興奮性出現(xiàn)了顯著降低。結(jié)論神經(jīng)元電興奮性的降低可能是導(dǎo)致VD的主要機(jī)制之一。
血管性癡呆;被動逃避反應(yīng)實驗;動作電位
血管性癡呆(VD)是因腦組織血液循環(huán)障礙所致的一種獲得性、進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙綜合征〔1〕。神經(jīng)元的信息傳遞是編碼為動作電位的形式進(jìn)行的,如果神經(jīng)元受到損傷,動作電位的形成變慢,信息的加工過程出現(xiàn)異常,進(jìn)而影響神經(jīng)元的功能〔2〕。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵中樞,也是缺血后最易受損的腦區(qū)之一〔3,4〕。本實驗觀察VD小鼠海馬神經(jīng)元的電生理改變。
1.1動物模型和分組 將40只9月齡雄性C57小鼠隨機(jī)分為:①假手術(shù)組:只暴露雙側(cè)頸總動脈,不阻斷血流。②模型組:分別暴露雙側(cè)頸總動脈,反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈3次,每次夾閉20 min,每次間隔10 min。
1.2避暗箱實驗 術(shù)后第22天,開始對所有動物進(jìn)行避暗箱測試,采用被電次數(shù)和避暗潛伏期作為學(xué)習(xí)記憶的檢測指標(biāo)。實驗的第1天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練:暗箱不通電,將小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中,令其可自由進(jìn)出暗箱,適應(yīng)5 min,記錄小鼠第1次進(jìn)入暗箱的時間為潛伏期。實驗的第2天進(jìn)行認(rèn)知訓(xùn)練:暗箱通電,將小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中,訓(xùn)練5 min,記錄小鼠進(jìn)入暗箱被電次數(shù)。實驗第3天進(jìn)行記憶檢測:暗箱通電,將小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中,記錄小鼠第1次進(jìn)入暗箱的時間即避暗潛伏期,如果在5 min內(nèi)小鼠不進(jìn)入暗箱,則避暗潛伏期記為300 s。
1.3腦組織病理學(xué)評價 動物在行為學(xué)測定結(jié)束后,斷頭取腦,冠狀切取視交叉后1~4 mm腦組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)腦組織切片(5 μm),硫堇染色觀察海馬組織學(xué)改變。高倍鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目,每張切片海馬各計數(shù)3個區(qū)段取平均數(shù)為神經(jīng)元密度(ND)。
1.4電流鉗記錄 動物在行為學(xué)測定結(jié)束后,將小鼠冰上快速斷頭取腦(1 min左右),冠狀切去部分額部、枕部,枕部切面用瞬間黏合劑粘固到振動切片機(jī)的平臺上。浸入冰水匯合氧飽和的人工腦脊液,在冠狀平面上切取5~6片皮層腦組織(300 μm厚度)。置于95%O2+5%CO2飽和的人工腦脊液孵育槽中,室溫下(21℃~26℃)孵育1 h備用。數(shù)據(jù)由MultiClamp 700B放大器采集,應(yīng)用全細(xì)胞電流鉗記錄模式,觀察了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元動作電位的頻率。
1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗。
2.1避暗箱實驗結(jié)果 與假手術(shù)組〔(22.9±0.3)s〕比較,在被動逃避反應(yīng)實驗第1天訓(xùn)練階段的潛伏期在模型組無明顯變化〔(24.1±13.8)s,P>0.05〕。在避暗箱實驗第2天學(xué)習(xí)階段,被電次數(shù)在模型組較假手術(shù)組顯著增多〔(2.7±1.2) vs (1.8±0.8)s,P<0.05〕。在實驗第3天,與假手術(shù)組小鼠相比,被動逃避潛伏期在模型組顯著縮短〔(174.2±105.3)vs (251.4±84.4)s,P<0.05〕。
2.2小鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)結(jié)果 假手術(shù)組和模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞3~5層,排列整齊致密,細(xì)胞形態(tài)完整,胞核飽滿,核仁清晰,均無明顯細(xì)胞缺失,見圖1。與假手術(shù)組(257.7±15.3)相比,模型組小鼠海馬CA1區(qū)ND有降低趨勢,但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(252.2±13.0,P>0.05)。
圖1 兩組海馬CA1區(qū)病理學(xué)結(jié)果(HE,×400)
2.3神經(jīng)元興奮性變化 與假手術(shù)組(23.3±3.3)相比,模型組小鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元動作電位產(chǎn)生個數(shù)(18.3±4.3)顯著減少(P<0.05),見圖2。
圖2 兩組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元動作電位示意圖
本文VD動物模型未觀察到神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯損傷,與國內(nèi)其他的VD模型中所描述的不同〔5〕。文獻(xiàn)報道神經(jīng)元興奮性的降低可以引起認(rèn)知功能損傷〔6〕,本研究中也印證了這一電生理現(xiàn)象在VD中的作用。文獻(xiàn)報道改善神經(jīng)元興奮性可以提高個體的認(rèn)知功能〔7,8〕,這就為臨床治療VD提供了新的思路,開發(fā)、尋找可以提高神經(jīng)元興奮性的藥物或物理治療方法,提高神經(jīng)元的興奮性;并以此為靶點為尋找改善VD認(rèn)知功能障礙的方法提供理論支持。調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性的離子通道主要有鉀離子通道,L型鈣離子通道〔8,9〕,具體是何種離子通道特性的改變引起的神經(jīng)元興奮性變化,針對這些神經(jīng)元興奮性變化的離子通道機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。
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〔2016-04-17修回〕
(編輯 苑云杰/曹夢園)
顧 平(1970-),女,博士,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,主要從事老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究。
韓 瑞(1977-),女,主治醫(yī)師,主要從事老年變性疾病研究。
R741.044
A
1005-9202(2017)17-4211-02;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.019
1 河北省古城縣醫(yī)院內(nèi)科