李辛慧，梁現(xiàn)蕊,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

鷹嘴豆中異黃酮類化合物體外模擬胃腸道代謝研究

李辛慧1，梁現(xiàn)蕊1,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

為了研究鷹嘴豆中異黃酮類化合物在體外模擬胃腸道中的代謝轉(zhuǎn)化.將鷹嘴豆提取液及其主要異黃酮單體化合物分別在模擬胃液、腸液和腸道菌群中孵育，并采用UPLC-QTOF-MS方法分析代謝物.結(jié)果顯示：鷹嘴豆提取液在模擬胃液和腸液中不發(fā)生代謝變化；在腸道菌群中芒柄花苷產(chǎn)生2個(gè)代謝物，6″-O-丙二酰芒柄花苷和6″-O-丙二酰印度黃檀苷分別產(chǎn)生4個(gè)代謝物，而芒柄花素和鷹嘴豆芽素A并未發(fā)生明顯變化；異黃酮苷主要的代謝方式有水解、去糖基化、羥基化和去羥基化.表明鷹嘴豆中異黃酮類化合物在模擬胃液、腸液中穩(wěn)定，腸道菌群對其代謝起了關(guān)鍵作用.

鷹嘴豆；異黃酮；模擬胃腸道；代謝；UPLC-QTOF-MS

鷹嘴豆(Cicerarietinum)屬豆科草本植物，也被稱為桃爾豆、雞豆、雞心豆等，在維吾爾族應(yīng)用較為廣泛，既可做食材，又可為藥材，被收錄在《維吾爾藥志》中.新疆民族醫(yī)院及民間用其治療糖尿病、腎虛、高脂血癥、氣管炎、霍亂、便秘、痢疾、消化不良和營養(yǎng)不良等.異黃酮類化合物是鷹嘴豆的主要化學(xué)成分，具有調(diào)節(jié)血糖、降低血脂[1]、降膽固醇、抑制CaCo-2細(xì)胞、改善學(xué)習(xí)記憶能力和抑制腫瘤細(xì)胞的生長等藥理作用[2].

天然藥物一般通過口服給藥，口服藥物進(jìn)入體內(nèi)后不可避免地進(jìn)入胃腸道.胃腸道中的pH環(huán)境、存在的代謝酶和腸道菌群會對藥物進(jìn)行初步代謝，改變藥物的結(jié)構(gòu)，增加或降低藥物活性，生物利用度低.其中腸道菌的代謝能力最強(qiáng)，是肝代謝的100倍[3-4].近年來，體外代謝模型越來越多地被用來研究天然藥物的代謝過程，以檢測藥物在人體消化道內(nèi)復(fù)雜的物理化學(xué)變化[5]：人參皂苷Re和Rb3在人工胃液中代謝后發(fā)生了脫糖基和脫水反應(yīng)[6]；McDougall等[7]考察了紫甘藍(lán)中18種不同結(jié)構(gòu)的花青素在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花青素在胃液中幾乎沒有發(fā)生變化，但在腸液中降解后生成新的多酚化合物；黃芩根的水提取液在模擬胃腸道中的代謝后，發(fā)現(xiàn)其在模擬胃液、腸液中穩(wěn)定，但在腸道菌群中異黃酮苷均轉(zhuǎn)化成各自苷元[8].傳統(tǒng)方法檢測天然藥物的代謝物時(shí)，一般先用溶劑提取，再用不同方法制備代謝物[9-11]，但由于代謝物的濃度低且成分復(fù)雜，傳統(tǒng)方法檢測時(shí)具有一定難度.近年來，色譜-光譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于代謝物的檢測，大大縮短了樣品分析時(shí)間，同時(shí)可準(zhǔn)確分析代謝物的結(jié)構(gòu).筆者主要采用UPLC-QTOF-MS方法研究鷹嘴豆提取液和其主要的異黃酮類化合物在模擬胃腸道中的代謝轉(zhuǎn)化，推導(dǎo)異黃酮的代謝途徑.

1 材料和儀器

鷹嘴豆購自新疆木壘；對照品芒柄花苷、芒柄花素、鷹嘴豆芽素A(上海阿拉丁試劑有限公司，純度≥98%)；單體化合物6″-O-丙二酰芒柄花苷和6″-O-丙二酰印度黃檀苷由實(shí)驗(yàn)室自制(純度≥95%)；色譜純甲醇、乙腈購自德國默克公司；本實(shí)驗(yàn)中的其他溶劑或試劑均為分析純(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；Waters Acquity超高效液相色譜儀(Waters，美國)；Bruker micrOTOF四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Bruker，美國)；XS205 DualRange分析天平(Mettler Toledo，瑞士)；Mettler Toledo Delta 320 pH計(jì)(Mettler Toledo，瑞士)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi，瑞士)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；Thermo Electron LED GmbH D-37520 Osterode離心機(jī)(Thermo Fisher，德國)；高壓蒸汽滅菌器(mLS-3780，日本三洋)；7 L厭氧培養(yǎng)罐，2.5 L厭氧產(chǎn)氣包和氧氣指示劑(日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鷹嘴豆提取液的制備

稱取鷹嘴豆粉末50 g，加入500 mL 70%乙醇溶液，浸泡1 h后，超聲提取30 min.提取兩次，合并提取液，真空旋干，再用20%乙醇溶解即得到鷹嘴豆提取液，用UPLC檢測后得色譜圖如圖1所示.1～5號峰分別為芒柄花苷、6″-O-丙二酰芒柄花苷、6″-O-丙二酰印度黃檀苷、芒柄花素和鷹嘴豆牙素A.

1—芒柄花苷；2—6″-O-丙二酰芒柄花苷；3—6″-O-丙二酰印度黃檀苷；4—芒柄花素；5—鷹嘴豆芽素A圖1 鷹嘴豆芽中各異黃酮成分Fig.1 The isoflavones in chickpea

2.2 鷹嘴豆提取液在模擬胃液和腸液中的代謝

取鷹嘴豆提取液1 mL，加入模擬胃液5 mL(pH=1.2，包含50 mg胃蛋白酶)，混勻后將放入搖床中(37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min)，分別于0，1，2，4 h取樣200 μL，加入1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，加入1 mL乙腈混勻，使酶失活；離心(1 000 r/min，15 min)，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，然后用UPLC-QTOF-MS檢測.每個(gè)樣品平行3 組.

取鷹嘴豆提取液1 mL，加入模擬腸液5 mL(pH=6.8，包含50 mg胰蛋白酶)，混勻后將放入搖床中(37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min)，分別于0，1，2，4，6 h取樣200 μL.樣品處理方法同模擬胃液代謝的樣品.

2.3 GAM培養(yǎng)基的配制

根據(jù)文獻(xiàn)[12]，取胰蛋白胨10 g，示蛋白胨10 g，消化血清粉13.5 g，酵母提取物5 g，大豆蛋白胨3 g，葡萄糖3 g，氯化鈉3 g，可溶性淀粉5 g，磷酸二氫鉀2.5 g，牛肉膏2.2 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.3 g，硫代乙酸鈉0.3 g，牛肝提取物1.2 g，加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2，定容到1 000 mL容量瓶，即得GAM培養(yǎng)基.121 ℃滅菌20 min，冷卻后備用.

2.4 腸道菌群的培育

取人體新鮮糞便4 g，加入20 mL已滅菌的生理鹽水，均質(zhì)混合.1 000 r/min離心20 min.取上清液，再加入滅菌生理鹽水稀釋2 倍，1 000 r/min離心15 min，取上清液即為人腸道菌液.將腸道菌液加入到GAM培養(yǎng)基中，混合均勻.于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h即得到腸道菌群孵育液.

2.5 鷹嘴豆中異黃酮類化合物在腸道菌群中的代謝

將芒柄花苷、6″-O-丙二酰芒柄花苷、6″-O-丙二酰印度黃檀苷、芒柄花素和鷹嘴豆牙素A用甲醇溶解，各取200 μL樣品溶液和空白甲醇于滅菌dorf管中，再分別加入1 mL腸道菌孵育液，混勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐中厭氧孵育；將厭氧培養(yǎng)罐放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于0，1，3，6，12，24，48 h取出樣品；樣品取出后，立即加入3 mL乙酸乙酯，渦流混懸，使腸道菌失活，終止反應(yīng)；離心(1 000 r/min，15 min)；取上清液真空旋干；加入1 mL甲醇溶解，過0.22 μm PTFE濾膜；取濾液用UPLC-QTOF-MS聯(lián)用技術(shù)檢測.每組樣品平行3 組.

2.6 UPLC-Q-TOF-MS檢測條件

色譜條件為Waters Acquity HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相A為0.05% 甲酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；檢測波長254 nm；柱溫25 ℃；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL.

表1 UPLC梯度洗脫程序

UPLC-QTOF-MS分析：UPLC條件同上，質(zhì)量掃描范圍m/z為50～5 000；掃描模式正離子模式；干燥氣(N2)溫度200 ℃；干燥氣(N2)流速6.0 L/min；霧化氣(N2)壓力0.8 bar；毛細(xì)管電壓(+)4 500 V；以0.01 mol/L三氟乙酸鈉溶液作為外標(biāo)校正相對分子質(zhì)量，數(shù)據(jù)通過Hystar軟件采集，由Bruker daltonics dataanalysis 4.0軟件處理.

3 結(jié)果與討論

3.1 鷹嘴豆提取液在模擬胃液和腸液中的穩(wěn)定性

鷹嘴豆提取液在模擬胃液、腸液中代謝后，各成分含量沒有明顯變化.用UPLC-QTOF-MS進(jìn)一步檢測，發(fā)現(xiàn)無新化合物產(chǎn)生.說明鷹嘴豆中異黃酮類化合物在模擬胃液(pH=1.2)、腸液(pH=6.8)中穩(wěn)定.

3.2 鷹嘴豆中異黃酮類成分在腸道菌群中代謝物的鑒定

芒柄花苷、6″-O-丙二酰芒柄花苷、6″-O-丙二酰印度黃檀苷、芒柄花素和鷹嘴豆芽素A分別在離體腸道菌群中孵育，不同時(shí)間點(diǎn)取出用UPLC檢測分析.以各化合物相對峰面積為參考，其含量變化見圖2.

圖2 鷹嘴豆中異黃酮成分代謝48 h后的含量 Fig.2 The content of isoflavones in chickpea after 48 h metabolism

從圖2可以看出：芒柄花苷、6″-O-丙二酰芒柄花苷和6″-O-丙二酰印度黃檀苷的相對峰面積隨著代謝時(shí)間的增加急劇減小，表示它們在離體腸道菌群中發(fā)生了代謝轉(zhuǎn)化；而芒柄花素和鷹嘴豆芽素A的相對峰面積隨孵育時(shí)間的增加，變化不大.用UPLC-QTOF-MS進(jìn)一步研究了各化合物的代謝變化：在芒柄花苷樣品中檢測到2 個(gè)代謝物(M1-1，M1-2)；在6″-O-丙二酰芒柄花苷樣品中檢測到4 個(gè)代謝物(M2-1，M2-2，M2-3，M2-4)；在6″-O-丙二酰印度黃檀苷樣品中也檢測到4 個(gè)代謝物(M3-1，M3-2，M3-3，M3-4)，見圖3.

圖3 母體藥物及其代謝產(chǎn)物的BPC圖Fig.3 The BPC of parent compounds and its metabolites

3.2.1 芒柄花苷代謝物的鑒定

芒柄花苷(M1-0)及其兩個(gè)代謝物(M1-1，M1-2)的保留時(shí)間、實(shí)測分子量和MS/MS碎片離子等數(shù)據(jù)見表2.M1-1的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z為269(保留時(shí)間為21.2 min)，比其母體結(jié)構(gòu)少162 Da(Glu，(431-269) Da)，恰好為一個(gè)葡萄糖分子的相對分子質(zhì)量，推測M1-1可能是M1-0的苷元成分.對比芒柄花素對照品的保留時(shí)間(圖4)，恰好與M1-1一致.進(jìn)一步分析M1-1的碎片離子，m/z分別為254，213，197，137，也與芒柄花素對照品的數(shù)據(jù)一致，由此可確定M1-1是芒柄花素.M1-2的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z為285(保留時(shí)間為25.3 min)，比M1-1多16 Da(O，(285-269) Da)，推測M1-2是M1-1羥基化的代謝物.Kulling等[13]研究發(fā)現(xiàn)異黃酮類化合物經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化后會產(chǎn)生2，5，6，3′位羥基化代謝物.分析M1-2的碎片離子發(fā)現(xiàn)，m/z分別為269，229，213，153，恰好與鷹嘴豆芽素A對照品的碎片離子相同，確定羥基化位點(diǎn)在5位.對比發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆芽素A對照品和M1-2的保留時(shí)間也一致(圖4)，由此確定M1-2為鷹嘴豆芽素A.推導(dǎo)芒柄花苷的代謝途徑為

圖4 對照品芒柄花素和鷹嘴豆芽素A的UPLC色譜圖 Fig.4 The UPLC chromatograms of formononetin and biochanin A

3.2.2 6″-O-丙二酰芒柄花苷代謝物的鑒定

6″-O-丙二酰芒柄花苷(M2-0)在離體腸道菌群中孵育后可檢測到4 個(gè)代謝物(M2-1，M2-2，M2-3，M2-4)，母體化合物及其代謝物的保留時(shí)間、實(shí)測分子量和MS/MS碎片離子等數(shù)據(jù)見表2.

M2-1和M2-0具有相同的分子離子峰[M+H]+，m/z為517(C25H25O12，保留時(shí)間14.3 min)，由此可以鑒定M2-1是母體藥物6″-O-丙二酰芒柄花苷的同分異構(gòu)體.

M2-2的分子離子峰[M+H]+m/z為431(C22H23O9，保留時(shí)間11.9 min)，與M2-0相比丟失了一個(gè)丙二酰基(Mal，(517-431) Da).通過對比保留時(shí)間和碎片離子m/z分別為269，254，213，137，可以鑒定M2-2是芒柄花苷.

表2 鷹嘴豆中各異黃酮及其代謝物的UPLC-QTOF-MS數(shù)據(jù)

M2-3的分子離子峰[M+H]+m/z為269(C16H13O4，保留時(shí)間21.2 min)，與M2-2相比失去162 Da，即丟失一個(gè)葡萄糖分子.其碎片離子m/z分別為254，213，197，137，與芒柄花素相同.由此可以鑒定M2-3是芒柄花苷脫糖基的產(chǎn)物，即芒柄花素.

M2-4的分子離子峰[M+H]+m/z為285(C16H13O5，保留時(shí)間25.3 min)，與M2-3相比增加了16 Da，可鑒定是M2-3羥基化的產(chǎn)物.同M1-2相同，M2-4的保留時(shí)間25.3 min與鷹嘴豆芽素A對照品的保留時(shí)間一致，比較碎片離子m/z分別為269，229，213，153，與鷹嘴豆芽素A也相同，由此可以鑒定M2-4是鷹嘴豆芽素A.

綜合4個(gè)代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，推導(dǎo)出6″-O-丙二酰芒柄花苷的代謝途徑為

3.2.3 6″-O-丙二酰印度黃檀苷代謝物的鑒定

6″-O-丙二酰印度黃檀苷(M3-0)在離體腸道菌群中孵育后同樣檢測到4個(gè)代謝物(M3-1，M3-2，M3-3，M3-4)，其UPLC-QTOF-MS數(shù)據(jù)見表2.

M3-1和M3-0具有相同的分子離子峰[M+H]+，m/z為533(C25H25O13，保留時(shí)間18.7 min)，由此可以鑒定M3-1是母體化合物6″-O-丙二酰印度黃檀苷的同分異構(gòu)體.

M3-2的分子離子峰[M+H]+m/z為447(C22H23O10，保留時(shí)間16.2 min)，與M3-0相比少86 Da，即丟失了一個(gè)丙二?；?進(jìn)一步分析其碎片離子m/z分別為285，269，213，153，發(fā)現(xiàn)碎片離子與鷹嘴豆芽素A相似.因此可以確定M3-2是M3-0水解后的產(chǎn)物，即印度黃檀苷.

M3-3的分子離子峰[M+H]+m/z為285(C16H13O5，保留時(shí)間25.3 min)，與M3-2相比失去162 Da，即丟失一個(gè)葡萄糖分子.可以鑒定M3-3是印度黃檀苷脫糖基的產(chǎn)物，即鷹嘴豆芽素A.

M3-4的分子離子峰[M+H]+m/z為269(C16H13O4，保留時(shí)間21.2 min)，與M3-3相比減少了16 Da，可鑒定是M3-3去羥基化的產(chǎn)物，對比保留時(shí)間21.2 min與芒柄花素相同，碎片離子m/z分別為254，213，197，137，與芒柄花素也一致，由此可證實(shí)M3-4是芒柄花素.

綜合4個(gè)代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，推導(dǎo)出6″-O-丙二酰印度黃檀苷的代謝途徑為

從芒柄花苷、6″-O-丙二酰芒柄花苷和6″-O-丙二酰印度黃檀苷的代謝結(jié)果得知，丙二?；漠慄S酮苷不穩(wěn)定，易水解為異黃酮葡萄糖苷.各異黃酮苷都先脫糖基為對應(yīng)的苷元成分，增加了脂溶性，使其更容易被吸收進(jìn)入血液，從而發(fā)揮藥效.苷元成分進(jìn)一步發(fā)生不同類型的代謝反應(yīng)，主要是Ι相代謝反應(yīng)包括羥基化、去羥基化.

4 結(jié) 論

筆者建立了快速、準(zhǔn)確的UPLC-QTOF-MS方法研究鷹嘴豆中異黃酮類化合物在體外模擬胃腸道中的代謝轉(zhuǎn)化.結(jié)果表明異黃酮類化合物在胃液、腸液中較穩(wěn)定.腸道菌群對異黃酮糖苷類化合物的代謝起著重要作用，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出：芒柄花苷產(chǎn)生了2個(gè)代謝物；6″-O-丙二酰芒柄花苷和6″-O-丙二酰印度黃檀苷分別產(chǎn)生了4個(gè)代謝物；主要的代謝途徑包括水解、脫糖基化、羥基化和去羥基化.傳統(tǒng)中藥以口服給藥為主，藥物成分到達(dá)體內(nèi)組織器官發(fā)揮藥效作用需要經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄等過程[7]，體外模擬代謝研究有助于我們了解藥物在體內(nèi)的變化過程.通過代謝物的鑒定和代謝途徑的推測，為篩選天然藥物中的活性成分提供依據(jù)，也為尋找先導(dǎo)化合物提供了參考.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Simulated gastrointestinal tract metabolism of the isoflavones from Chickpeas

LI Xinhui1, LIANG Xianrui1,2

(1.Collaborative Innovation Center of Yangtze River Delta Region Green Pharmaceuticals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The metabolic transformation of isoflavones from chickpeas in simulated gastrointestinal tract was investigated. The UPLC-QTOF-MS was applied to monitor theinvitrometabolic process of chickpeas extract and its isoflavone compounds incubated in simulated gastric juice, intestinal juice and human intestinal flora, respectively. The extract of chickpeas unchanged during the incubation with simulated gastric juice and intestinal juice. 2 metabolites were identified from ononin, 4 metabolites from formononetin 7-O-β-D-glucoside 6″-O-malonate, and 4 from biochanin A 7-O-β-D-glucoside 6″-O-malonate in human intestinal flora, respectively. However, formononetin and biochanin A didn’t change significantly in human intestinal flora. The main metabolic process of isoflavone included hydrolysis, deglycosylation, dehydroxylation and hydroxylation. The results showed that isoflavones in chickpeas were stable in simulated gastric juice and intestinal juice, and intestinal flora played an important role in the metabolism of isoflavones from chickpeas.

chickpeas; isoflavones; simulated gastrointestinal tract; metabolism; UPLC-QTOF-MS

2017-03-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21206148)

李辛慧(1991—)，女，浙江諸暨人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锝Y(jié)構(gòu)分析，E-mail：1065280757@qq.com.通信作者：梁現(xiàn)蕊副教授，E-mail：liangxrvicky@zjut.edu.cn.

R284

A

1674-2214(2017)03-0147-06