李然，林勵，祁龍凱，杜海芳，李靜，蔡聰，鄭來安，葉耀祥

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省湛江南藥試驗場，廣東 遂溪 524338； 3.廣東中檀實業(yè)有限公司，廣東 臺山 529200)

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HPLC法測定印度黃檀中黃檀素等3種成分含量

李然1，林勵1，祁龍凱1，杜海芳1，李靜1，蔡聰2，鄭來安2，葉耀祥3

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省湛江南藥試驗場，廣東 遂溪 524338； 3.廣東中檀實業(yè)有限公司，廣東 臺山 529200)

摘要:目的 建立印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法。方法 色譜柱為Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2 %(體積分?jǐn)?shù))H3PO4水溶液；梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀素檢測波長分別為260、254、280 nm。結(jié)果 黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌的平均回收率分別為98.24%、99.66%、99.06%，RSD值分別為1.57%、0.98%、1.29%。國內(nèi)引種印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為0.756%～2.347%、0.059%～0.349%、0.047%～1.240%。結(jié)論 本方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可用于印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定。

關(guān)鍵詞:印度黃檀； 高效液相色譜法； 黃檀素； 黃檀素甲醚； 4-甲氧基黃檀醌

印度黃檀DalbergiasissooRoxb.為豆科黃檀屬(Dalbergia)落葉半落葉大喬木，原產(chǎn)于印度、尼泊爾、巴基斯坦、孟加拉國、巴西、馬達(dá)加斯加等國[1]，我國主要引種于廣東、廣西、云南等地，被列為QB/T2385-200X《深色名貴硬木家具》中的紅酸枝木類[2]。印度黃檀為中藥降香原植物降香檀D.odorifera同屬植物，其心材曾進(jìn)口作為降香藥材使用，即《本草綱目》木部降真香所載“俗呼舶上來者為番降”中的番降，具有化瘀止血、理氣止痛功效[3]。該植物生長迅速，尤其在生長初期，株高及胸徑一般可達(dá)同齡降香檀的2倍左右，種植5年生的印度黃檀一般就能形成心材，10～15 a基本成材[4]。

印度黃檀心材主要含揮發(fā)油和黃酮類成分[5-6]，其主要成分黃檀素(黃檀內(nèi)酯)具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化[7]等生物活性，對離體兔心有顯著增加冠脈流量、減慢心率、輕度增加心跳幅度的作用[8]，對兔血漿有微弱的抗凝作用[9]；4-甲氧基黃檀醌則表現(xiàn)出顯著的抗感染活性[10]。

迄今為止尚鮮見對印度黃檀中黃檀素等成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的報道。為此，本文對國內(nèi)引種的印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定，以期為該藥材的質(zhì)量評價及產(chǎn)品開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

E2695型高效液相色譜儀(2998檢測器，Empower3軟件，美國Waters公司)；BP 211D型電子分析天平(十萬分之一，瑞士Sartorious公司)；XS 225A型電子分析天平(萬分之一，瑞士Precisa公司)；KQ500型超聲波清洗器(功率500 W，頻率40 kHz，昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥

印度黃檀各樣品經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)林勵研究員鑒定為豆科植物印度黃檀D.sissooRoxb.的心材，其來源見表1；黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌對照品均為自制(經(jīng)面積歸一化法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%)；甲醇 (德國Merck公司，色譜純)；乙腈 (德國Merck公司，色譜純)；H3PO4(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2方法

2.1混合對照品溶液的制備

分別取黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，溶解，搖勻，得黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌質(zhì)量濃度分別為0.764、0.868、0.892 mg/mL的對照品溶液。上述3種對照品溶液各取1 mL混合，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

表19批印度黃檀的來源信息表

Table 1The information of 9 batches ofDalbergiasissooRoxb. samples

編號產(chǎn)地生長年限/aS1廣東省湛江南藥試驗場40S2云南省紅河州14S3云南省玉溪市元江熱帶林科所12S4云南省玉溪市12S5云南省紅河州8S6廣東省湛江南藥試驗場6S7廣東省江門市開平縣百合鎮(zhèn)5S8廣東省江門市開平縣百合鎮(zhèn)4S9廣東省梅州市3

2.2供試品溶液的制備

取印度黃檀干燥心材，粉碎(過2號藥篩)，稱取約0.5 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量。超聲提取30 min，補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻。用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3檢測波長的選擇

在210～400 nm全波長掃描S1供試品溶液發(fā)現(xiàn)黃檀素在260 nm有較強(qiáng)吸收，黃檀素甲醚在254 nm有較強(qiáng)吸收峰，4-甲氧基黃檀醌在280 nm有較強(qiáng)吸收峰，故分別采用260、254、280 nm為測定波長。

2.4色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4水溶液，梯度洗脫條件見表2。流速：1 mL/min；檢測波長：0～23 min為260 nm，23～27 min為254 nm，27～52 min為280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。分別精密吸取混合對照品、供試品溶液 10 μL進(jìn)樣，按上述條件測定，所得圖譜見圖1。

表2印度黃檀中3種成分的梯度洗脫條件

Table 2Gradient elution program in the determinations of 3 constituents from ofDalbergiasissooRoxb.

t/minφ(甲醇)/%φ(0.2%H3PO4)/%03070156040306139451000491000503070523070

231123AB0.250.200.150.100.050.000.150.100.050.00AU05101520253035404550t/minAU

1.黃檀素； 2.黃檀素甲醚； 3. 4-甲氧基黃檀醌。

圖1混合對照品(A)、供試品(B)溶液的HPLC色譜圖

Figure 1HPLC chromatograms of reference substances(A)and test sample(B)

2.5線性關(guān)系的考察

分別精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，按“2.4”項下色譜條件進(jìn)樣分析，分別以各成分質(zhì)量濃度(ρ)對峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，所得回歸方程及線性范圍見表3。

2.6精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按“2.4”項下色譜條件測定并計算，結(jié)果黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌峰面積的RSD值分別為2.32%、1.66%、2.76%。

表3　黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的回歸方程

2.7穩(wěn)定性試驗

取印度黃檀樣品(S1)約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，在0、2、4、6、8、10 h分別進(jìn)樣，按“2.4”項下色譜條件連續(xù)測定6次，結(jié)果黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌峰面積的RSD值分別為0.84%、1.48%、2.28%。表明供試品溶液室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗

取印度黃檀樣品(S1)0.5 g，精密稱定，平行操作5份。分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定。結(jié)果黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌峰面積的RSD值分別為1.88 %、0.35%、0.71%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗

稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的S1號印度黃檀樣品6份，每份約0.1 g，每2份為1組，精密稱定，每組分別準(zhǔn)確加入新配置的黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌質(zhì)量濃度分別為0.764、0.868、0.892 mg/mL的混合對照品溶液1、2、3 mL，加甲醇至10 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻。分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，計算回收率及其RSD值。結(jié)果如表4～表6所示，表明本方法加樣回收率良好。

2. 10樣品的測定

取9批不同來源印度黃檀心材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每批制備3份，按“2.4”項下色譜條件測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及峰面積計算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表7。

表4印度黃檀中黃檀素的加樣回收率試驗結(jié)果

Table 4Recovery results of dalbergin inDalbergiasissooRoxb. (n=6)

樣品量/mg樣品中的量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%100.9141.9010.7642.64196.843100.1551.8870.7642.652100.181101.2421.9071.5283.42299.123100.9601.9021.5283.38997.318100.8821.9012.2924.11296.491100.9421.9022.2924.18199.453平均回收率=98.24%,RSD=1.57%

表5印度黃檀中黃檀素甲醚的加樣回收率試驗結(jié)果

Table 5Recovery results ofO-methyldalbergin inDalbergiasissooRoxb. (n=6)

樣品量/mg樣品中的量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%100.8820.3520.8681.220100.003100.9420.3520.8681.231101.257101.2420.3531.7362.08199.526100.9600.3521.7362.07199.012100.9140.3522.6042.95199.805100.1550.3502.6042.91198.374平均回收率=99.66%,RSD=0.98%

表6印度黃檀中4-甲氧基黃檀醌的加樣回收率試驗結(jié)果

Table 6 Recovery results of 4-methoxydalbergione inDalbergiasissooRoxb. (n=6)

樣品量/mg樣品中的量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%101.2420.7180.8921.58196.782100.9600.7160.8921.610100.268100.8820.7151.7842.48999.442100.9420.7161.7842.47198.398100.8860.7152.6763.38999.905100.9410.7162.6763.38099.556平均回收率=99.06%,RSD=1.29%

表79批印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

Table 7 Determination results of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione inDalbergiasissooRoxb.

w/%

3討論

通過測定9批印度黃檀樣品得知，國內(nèi)引種印度黃檀中主要有效成分黃檀素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，在0.756%～2.347%范圍內(nèi)，其中以湛江引種的印度黃檀S1、S6中黃檀素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高且比較穩(wěn)定，云南引種印度黃檀S2～S5中黃檀素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大。黃檀素甲醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.059%～0.326%，以S1、S6質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。4-甲氧基黃檀醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.047%～1.240%，在S2～S5中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，以S7、S8和S9(生長年限分別為5、4和3 a)為高，提示在樹齡較低的印度黃檀中4-甲氧基黃檀醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，隨著樹齡增加此成分長較慢。由此可見,印度黃檀的生長環(huán)境、栽培條件、生長年限等因素對其化學(xué)成分影響較大。

本文采用HPLC法測定了印度黃檀中3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，該法靈敏度高，簡單、快速，能準(zhǔn)確有效地測定印度黃檀化學(xué)成分、尤其是主要有效成分黃檀素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為建立印度黃檀的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Quantitative determination of dalbergin and other two compounds inDalbergiasissooRoxb. by HPLC

LI Ran1,LIN Li1,QI Longkai1,DU Haifang1,LI Jing1,CAI Cong2,ZHENG Lai′an2,YE Yaoxiang3

(1.SchoolofChineseHerbalMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2.ZhanjiangSouthMedicineFieldTestingGround,Suixi524338,China; 3.ZhongtanIndustrialCo.,LTDinGuangdong,Taishan529200,China)

Abstract:Objective To establish an HPLC method for the quantitative determination of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione in Dalbergia sissoo Roxb.Methods The separation was performed on Waters Symmetry C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) eluted with a mobile phase of methanol-0.2% phosphoric acid solution in a gradient elution. The detection wavelength of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione were 260,254 and 280 nm,respectively.Results The average recoveries of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione were 98.24%,99.66%,and 99.06%,with RSD of 1.57%,0.98% and 1.29%,respectively. The contents of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione were in the range of 0.756%-2.347%,0.059%-0.349%,and 0.047%-1.240% in the introduced Dalbergia sissoo Roxb.Conclusion The HPLC method is accurate and reproducible for the quantitative determinations of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione in Dalbergia sissoo Roxb.

Key words:Dalbergia sissoo Roxb.; HPLC; dalbergin; O-methyldalbergin; 4-methoxydalbergione

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015102101

中圖分類號:R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0051-04

作者簡介：李然(1985—)，男，2013級博士生，從事中藥資源開發(fā)與新藥研發(fā)，Email:wwwlr@163.com；通信作者：林勵(1954—)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥資源開發(fā)與新藥研發(fā)，Email：LL76611@126.com。

收稿日期：2015-10-21

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-15 18:33網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1833.009.html