金建強，吳哲明，鄭仁朝

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

酰胺酶催化機制研究進展

金建強，吳哲明，鄭仁朝

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

酰胺酶是一類主要作用于分子內C—N鍵，催化酰胺水解生成相應的羧酸和氨的水解酶，在自然界中廣泛存在.根據(jù)酰胺酶氨基酸序列，可將其分為腈水解酶家族和酰胺酶標簽家族兩類.綜述了近年來對上述兩類酰胺酶結構和催化機制方面的研究進展，并著重闡述了數(shù)個不同來源酰胺酶的具體催化過程.腈水解酶家族成員的催化三聯(lián)體為Cys-Lys-Glu，其催化過程比較一致，Cys主要負責親核進攻，Glu作為廣義堿參與催化反應，Lys則負責穩(wěn)定過渡態(tài).酰胺酶標簽家族酰胺酶的催化三聯(lián)體為Ser-cisSer-Lys，但不同來源的酰胺酶之間的催化機理差異較大，依據(jù)Lys所扮演的角色可以將其催化機制分為廣義酸催化和廣義堿催化兩種模式.

酰胺酶；腈水解酶家族；酰胺酶標簽家族；催化機制

酰胺酶(Amidase，EC 3.5.1.x)又稱酰胺水解酶(Amidohydrolase)，是一類能夠催化酰胺鍵斷裂生成相應羧酸和氨的水解酶，廣泛存在于細菌(廣譜酰胺酶)、霉菌(青霉素?；?、真菌(甲酰胺酶，乙酰胺酶以及廣譜酰胺酶)、酵母(煙酰胺酶以及廣譜酰胺酶)、植物(肽酶)和動物(花生四烯酸乙醇胺酰胺酶)等[1-2]生物體中.Claridge等[3]曾于1960年報道了青霉素酰化酶(Penicillin amidase).隨后，Kelly和Jakoby于1964年分別從Pseudomonasaeruginosa和Pseudomonasfluorescens中發(fā)現(xiàn)了酰胺酶[4-5].絕大部分酰胺酶的底物譜廣，能高效催化各種脂肪族、芳香族以及雜環(huán)族酰胺的水解.酰胺酶因具有良好的化學和立體選擇性，在手性羧酸、酰胺衍生物和光學純氨基酸等手性化合物的合成中極具潛力，正日益受到工業(yè)界的重視.

隨著對酰胺酶研究的不斷深入，其分子結構和催化機制成為了研究者關注的重點.分析多種酰胺酶之間的結構及其催化機理有助于系統(tǒng)并深入地理解其空間結構與功能的關系.近年來，關于酰胺酶結構和催化機制的研究已經(jīng)有了一定的進展.筆者主要闡述了一些酰胺酶的結構和催化機制，為酰胺酶的催化反應研究提供理論基礎.

1 酰胺酶的分類及結構

根據(jù)酰胺酶的氨基酸序列，可以將其大致分為兩類[2,6]：腈水解酶家族(Nitrilase superfamily)酰胺酶，其催化三聯(lián)體為Cys-Lys-Glu；酰胺酶標簽(Amidase signature，AS)家族酰胺酶，以Lys-Ser-Ser為催化三聯(lián)體，在其一級結構中含有一段約130 個保守氨基酸殘基且富含GGSS序列片段的特征序列(標簽序列)[7].

腈水解酶家族酰胺酶是一類巰基酶，含有保守的親核半胱氨酸[8].腈水解酶家族酰胺酶的底物譜較窄，通常只能催化脂肪族酰胺水解.該家族酰胺酶和腈水解酶具有序列相似性，其與腈水解酶可能存在進化上的相關性.腈水解酶家族酰胺酶多重序列比對結果表明，其一級結構含有許多保守片段，并且與腈水解酶、腈水合酶和β-丙氨酸合成酶同源.腈水解酶家族成員的四級結構通常為同源四聚體或同源六聚體.其單體一般呈α-β-β-α式夾心折疊結構，并且有一個高度保守的催化三聯(lián)體Cys-Lys-Glu負責共價鍵催化(圖1)，其中Cys為親核體[9].有關腈水解酶家族酰胺酶的晶體結構很少，已報道的該家族酰胺酶主要來源于Geobacilluspallidus[9-11]，P.aeruginosa[12]，Agrobacteriumsp.[13]和Helicobacterpylori[14]等.圖1中：Agrobacterium為N-carbamyl-D-amino acid amidohydrolase (DCase) A鏈，來源于Agrobacteriumsp. KNK712，PDB ID code: 1ERZ；Helicobacter為Formamidase (AmiF) A鏈，來源于Helicobacterpylori，PDB ID code: 2DYU；Geobacillus為Geobacilluspallidus酰胺酶，來源于GeobacilluspallidusRAPc8，PDB ID code: 2PLQ；Pseudomonas為Aliphatic amidase，來源于Pseudomonasaeruginosa，GenBank accession No. KSP66314.1；催化三聯(lián)體Cys-Lys-Glu以▼標記.

圖1 腈水解酶家族酰胺酶序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of nitrilase superfamily

酰胺酶標簽家族酰胺酶與腈水解酶家族成員有明顯的區(qū)別.該家族酰胺酶通常有較寬的底物譜，可催化如脂肪族酰胺、芳香族酰胺、雜環(huán)類酰胺和α-取代酰胺等的水解.其四級結構與腈水解酶家族成員不同，一般呈同源二聚體或同源八聚體[8,15-16].標簽家族成員的催化三聯(lián)體并非典型的絲氨酸水解酶類結構(Ser-Asp-His)[7]，而是Ser-cisSer-Lys.其中Ser作為親核體通過其側鏈上的羥基氧(Oγ)對底物的羰基發(fā)動親核進攻，而cisSer為不常見的順式結構，處于GGSS指紋序列的中心位置(圖2)，并與Lys一起組成了質子傳遞網(wǎng)絡.此外，親核體Ser以及與其相連的2～3 個保守氨基酸(通常為Gly，Thr或Asp)構成了活性中心的發(fā)卡環(huán)結構，參與氧負離子洞的形成.目前關于酰胺酶標簽家族酰胺酶的結構報道包括Malonamidase E2 (MAE2)[7,17]，Glu-tRNAGln-dependent amidotransferase (GatCAB)[18]，6-aminohexanoate cyclic dimer hydrolase (NylA)[19]，F(xiàn)atty acid amide hydrolase (FAAH)[20-22]，Peptide amidase (Pam)[23]和Aryl acylamidase (AAA)[24]等.圖2中：PAM為Peptide amidase，來源于Stenotrophomonasmaltophilia，GenBank acession No. CAC93616；MAE2為Malonamidase E2，來源于Bradyrhizobiumjaponicum，GenBank acession No. AAD01507；NylA為6-aminohexanoate cyclic dimer hydrolase，來源于Arthrobactersp. KI72，PDB ID code: 3A2P；AAA為Aryl acylamidase，來源于某土壤細菌CSBL00001，PDB ID code: 4YJI；FAAH為Fatty acid amide hydrolase，來源于Rattusnorvegicus，PDB ID code: 2VYA；催化三聯(lián)體Ser-cisSer-Lys以▼標記.

圖2 酰胺酶標簽家族酰胺酶序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of amidase signature family

此外，絕大多數(shù)酰胺酶不含金屬離子，但有一些研究者報道了Rhodococcussp.[25]，KlebsiellapneumoniaeNCTR 1[26]和BrevundimonasdiminutaTPU 5720[27]的酰胺酶的活性位點上含有Co2+和/或Fe3+.

2 酰胺酶的催化機制

酰胺酶可以催化包括酰胺水解、酰基轉移、酸轉移、酯水解和酯轉移等在內的多種反應，但以酰胺水解和?；D移反應的活性最高[1-2].當反應體系存在羥胺時，由于羥胺具有比水更強的親核性，底物酰胺會優(yōu)先和羥胺發(fā)生酰基轉移反應.1986年，Maestracci等[28]基于此特性研究了Brevibacteriumsp. R312酰胺酶的?；D移反應.他們以乙酰胺和羥胺為雙底物，發(fā)現(xiàn)該反應符合“Bi-Bi Ping-Pong”機制.在酰基轉移反應中，酰胺酶首先與底物酰胺結合形成酶-底物-酰基中間體，同時釋放出氨；隨后親核試劑羥胺與中間體反應生成氧肟酸；最后氧肟酸脫離，酰胺酶恢復為初始狀態(tài).隨后，Kobayashi等[29]提出了酰胺酶的催化機制，他們認為底物酰胺的羰基在受到親核進攻后，會與酶形成一個四面體中間體.中間體存在時間極短，其因氨的形成并脫離而快速轉變?yōu)轷；?酶復合物.在水分子加入后，?；?酶復合物發(fā)生水解，酶脫離并形成相應的酸.Fournand等[2]通過對酰胺酶的酰胺水解反應以及?；D移反應研究，同樣確認了兩者反應過程均符合“Bi-Bi Ping-Pong”機制.酰胺酶?；D移反應和水解反應的“Bi-Bi Ping-Pong”機制[1-2]為

2.1 腈水解酶家族酰胺酶的催化機制

有關腈水解酶家族酰胺酶催化機理的研究較少，已報道的主要集中于N-carbamyl-D-amino acid amidohydrolase (DCase)，F(xiàn)ormamidase (AmiF)和G.pallidusRAPc8 aliphatic amidase等少數(shù)幾個酶中.從這幾個酶來看，腈水解酶家族酰胺酶的催化過程比較一致：催化三聯(lián)體中，Cys負責親核進攻，處于去質子化狀態(tài)的Glu作為廣義堿，增強Cys的親核性并負責質子的傳遞，而Lys則是用于穩(wěn)定催化過程中的過渡態(tài)，并不直接參與質子傳遞.Nakai等[13]對來源于Agrobacteriumsp. KNK712的N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(DCase)進行了晶體結構解析，確認其催化三聯(lián)體為Cys171-Lys126-Glu46，并提出了該酶的具體催化過程：

1) Glu46處于去質子化狀態(tài)，直接與Cys171相互作用，奪取后者巰基上的質子，激活其親核進攻能力.活化的Cys171進攻底物的羰基碳，形成帶氧負離子的酶-底物復合體，并被Lys126所穩(wěn)定.

2) 復合體的氨基氮奪取Glu46的質子變?yōu)榘狈肿佣撾x，羰基重新形成，構成?；?酶中間體，Glu46恢復去質子化狀態(tài).

3) 水分子取代氨分子進入反應中心，被Glu46奪去一個質子后，成為活化狀態(tài)，進攻?；?酶中間體并與之共價結合，而羰基再次解體產(chǎn)生氧負離子.

4) 中間體解體，Cys171脫離并獲得Glu46的質子，恢復穩(wěn)定.羰基恢復，形成催化產(chǎn)物N-羧基氨基酸，并進一步自發(fā)水解為氨基酸和二氧化碳.

DCase的催化機制[13]為

另一種報道的腈水解酶家族成員為來源于H.pylori的甲酰胺酶(AmiF)，AmiF的催化機制[14]為Hung等[14]通過對AmiF晶體結構的解析，認為該酶的具體催化步驟為：

1) 底物甲酰胺分子進入催化活性中心，去質子化的Glu60奪取Cys166的巰基質子，激活其親核進攻反應.Cys166與底物共價結合，形成帶氧負離子的酶-底物復合體，并被Lys133和His167通過氫鍵所穩(wěn)定.

2) 底物氨基獲得Glu60的質子形成氨被釋放，復合體分解，羰基恢復，構成?；?酶中間體.

3) 水分子進入反應中心，經(jīng)Glu60活化后進攻酰基-酶中間體.中間體分解，羰基恢復，形成產(chǎn)物甲酸，Cys166從Glu60處獲得質子，三聯(lián)體恢復初始狀態(tài).

2.2 酰胺酶標簽家族酰胺酶的催化機理

2.2.1 去質子化Lys介導的廣義堿催化模式

脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)是一種來源于哺乳動物的內源性大麻素降解酶，屬于典型的酰胺酶標簽家族酰胺酶，關于其結構研究的報道較多[31-36].Patricelli等[36-37]研究結果表明：催化初始階段，F(xiàn)AAH的Lys142并未處于質子化狀態(tài)，而是作為廣義堿接受來自cisSer217的質子.其具體催化步驟[31-33]如下：

1) 處于去質子化狀態(tài)的Lys142首先奪取cisSer217的質子，失去質子的cisSer217則奪取Ser241的質子，激活Ser241的親核能力.

2) 活化的Ser241進攻底物中的羰基碳并與之共價結合，羰基解體，產(chǎn)生氧負離子(由Gly240-Gly239-Ile238構成的氧負離子洞穩(wěn)定)，形成酶-底物復合體.與此同時，cisSer217將其質子貢獻給氨基氮，并獲得Lys142的質子補償，兩者恢復去質子化狀態(tài).

3) 酰胺底物的C—N鍵斷裂，形成胺脫離復合體，羰基重新恢復，形成?；?酶中間體.隨后，Lys142再次質子化，獲得cisSer217的羥基氫.而失去質子的cisSer217作為廣義堿奪取水分子的一個質子，并激活水分子的親核進攻能力.活化的水分子(即HO-部分)進攻?；?酶中間體的羰基碳，羰基再次解體并產(chǎn)生氧負離子，形成新的四面體中間體.

4) 最后，中間體分解、羰基恢復，形成第二個產(chǎn)物——羧酸.Ser241脫離后獲得cisSer217的質子，而后者則得到Lys142的質子補償，三聯(lián)體恢復初始狀態(tài).

酰胺酶FAAH催化機制[33]為

芳基?；０访?AAA)以Ser187，Ser163與Lys84作為催化三聯(lián)體，其中Lys84同樣是作為廣義堿角色，接受來自Ser163的質子，并輔助Ser163活化親核體Ser187[24].但其催化步驟與FAAH并不完全相同，主要包括：

1) 在堿性環(huán)境(pH>10)下的Lys84處于去質子化狀態(tài)，其通過質子傳遞網(wǎng)絡獲得cisSer163的質子，并使之轉而奪取親核體Ser187上的質子，激活Ser187對底物的親核進攻反應.

2) 去質子化的Ser187與底物(對乙酰氨基酚)的羰基碳共價結合，氧負離子則由發(fā)卡環(huán)上的兩個氨基酸殘基(Gly185和Gly184)通過氫鍵穩(wěn)定，構成四面體中間體.

3)cisSer163質子化底物的亞氨基，形成對氨基苯酚脫離催化體系.失去質子的cisSer163直接奪取水分子上的質子，并激活其對中間體的脫酰反應.

4) 活化的水分子進攻中間體并與之結合，導致Ser187脫離，中間體解體，羰基恢復，形成羧酸.Ser187則奪取cisSer163的質子，后者則拿回在Lys84上的質子.最終酶與產(chǎn)物分離，酰胺酶獲得再生.

酰胺酶AAA的催化機制[24]為

2.2.2 質子化Lys介導的廣義酸催化模式

Labahn等[23]測定了Stenotrophomonasmaltophilia的肽酰胺酶Pam的四級結構，確定其催化三聯(lián)體為Ser226-cisSer202-Lys123.他們認為Pam的Lys123在催化起始階段就處于質子化狀態(tài)，作為廣義酸參與反應，并據(jù)此提出了相應的催化機制.該假設得到了動力學模擬研究結果的支持[30].Pam的具體水解反應過程為：

1) 處于質子化狀態(tài)的Lys123降低了cisSer202的親核性，但同時增強了cisSer202對底物酰胺羰基氧的質子化能力.Ser226作為親核體首先進攻底物酰胺的羰基碳原子，同時cisSer202質子化羰基氧.隨后，失去質子的cisSer202奪取Ser226的質子，形成酶-底物復合體.

2) 復合體上的氨基奪取cisSer202的質子，失去質子的cisSer202轉而攻擊帶正電的Lys123并獲得質子補償，恢復穩(wěn)定.

3) 質子化的氨基形成氨脫離復合體.Lys123重新奪回cisSer202上的質子，而cisSer202則獲得底物上的羥基質子，兩者恢復原來狀態(tài).同時，底物的羰基也重新產(chǎn)生，形成酶-?；虚g體.

4) 隨后，與Ser226通過氫鍵連接的水分子進攻酶-?；虚g體使其分解，形成產(chǎn)物羧酸.同時Ser226獲得水分子上的一個質子，重新恢復穩(wěn)定狀態(tài).

酰胺酶PAM的催化機制[23]為

Shin等[7,17]對丙二酰胺酶MAE2的研究表明，其Lys62同樣處于質子化狀態(tài).但與Pam有所區(qū)別，MAE2的親核體Ser155由于受到Arg158的胍基的影響，其pKa降低，因此他們認為親核體Ser155在催化初始階段就處于去質子化狀態(tài)(Ser155—O-)，并且通過與cisSer131形成兩個氫鍵來保持穩(wěn)定性.該酶的具體催化機制如下：

1) Lys62處于質子化狀態(tài)，而Ser155處于去質子化狀態(tài).在該狀態(tài)下，Ser131的親核性被減弱，但其質子化底物酰胺羰基氧的能力得到加強.催化開始時，處于激活狀態(tài)下Ser177側鏈氧原子(Oγ-)攻擊底物酰胺上的羰基碳，與之共價結合，形成攜帶氧負離子的酶-底物復合體，并被Thr152，Gly153，Gly154以及Ser155組成的氧負離子洞所穩(wěn)定.

2) 緊接著，cisSer131作為酸催化劑將其側鏈上的質子傳遞給復合體上的底物氨基使其質子化，形成氨脫離反應體系.同時，羰基恢復，最終形成酶-?；虚g體.失去質子的cisSer131則從質子化狀態(tài)下的Lys80那里獲得質子補償.

3) 隨后，水分子進入反應中心.Lys80重新拿回cisSer131上的質子，后者被活化，進攻水分子并獲得質子補償，恢復穩(wěn)定狀態(tài).而失去質子的水分子則進攻酶-?；虚g體，使其水解并形成羧酸.而Ser155則脫離并恢復為去質子化狀態(tài).至此，MAE2完成一個底物的水解反應過程.

MAE2的催化機制[17]為

來源于Arthrobactersp. KI72的NylA的催化過程與MAE2基本類似，但初始狀態(tài)的Ser174并未處于去質子化狀態(tài)，需要Ser150的激活才能進行親核進攻[19].

3 結 論

作為一類應用廣泛的生物催化劑，酰胺酶近年來受到越來越多的關注，不斷有各種酰胺酶的空間結構被鑒定和解析，其相應的催化反應機制也逐漸被揭示.空間結構與催化機制的闡明對于酰胺酶的開發(fā)、改造和應用具有重要的意義.根據(jù)已知的酰胺酶結構，通過分子對接和動力學等方法研究藥物與酶的結合模式和作用關鍵殘基，可以使藥物改造具有更好的方向性和針對性.通過探究酰胺酶的結構和作用機理，有助于準確高效地利用基因重組技術和蛋白質工程等手段改造酰胺酶，提升其催化活力和穩(wěn)定性，為酰胺酶的工業(yè)化應用奠定基礎.然而，酰胺酶來源廣泛、類型眾多，其催化過程并不相同，目前還沒有統(tǒng)一的催化機制來解釋其反應過程.另外，一些金屬依賴型酰胺酶的催化機制并未明確.因此，對酰胺酶催化機理的研究仍有待深入.

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(責任編輯：朱小惠)

Progress on the catalytic mechanism of amidase

JIN Jianqiang, WU Zheming, ZHENG Renchao

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Amidases are a class of hydrolases, which catalyze the hydrolysis of C—N bonds of various amides to the corresponding carboxylic acids and ammonia. They are ubiquitous in many different types of organisms. According to their amino acid sequences, amidases can be assigned into nitrilase superfamily and amidase signature family. Here, we systematically review the progress of study in molecular structures and catalytic mechanisms of amidases, as well as the specific catalytic processes of specific amidases. All members of the nitrilase superfamily possess the conserved catalytic triad Cys-Lys-Glu, and exhibit similar catalytic processes. The residue Cys is responsible for the nucleophilic attack, Glu acts as a general base, while Lys is involved in the stabilization of the transition states. As for amidase signature family, the conserved catalytic triad is Ser-cisSer-Lys, and the catalytic processes vary from different signature amidases. According to the role of Lys, the catalytic mechanism can be divided into two types: general acid catalysis and general base catalysis.

amidase; nitrilase superfamily; amidase signature family; catalytic mechanism

2017-04-29

國家自然科學基金資助項目(21602199)

金建強(1991—)，男，浙江臺州人，碩士研究生，研究方向為生物催化與酶工程，E-mail: jinjq6967@163.com. 通信作者：鄭仁朝教授，E-mail: zhengrc@zjut.edu.cn.

Q556.4

A

1674-2214(2017)03-0170-08