李智祥，趙 磊，梁云龍，張成林,2,3

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457； 3. 天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457)

生物法合成5-氨基乙酰丙酸的研究進(jìn)展

李智祥1，趙 磊1，梁云龍1，張成林1,2,3

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457； 3. 天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是血紅素、葉綠素等吡咯化合物生物合成的重要前體，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥上得到廣泛應(yīng)用.5-氨基乙酰丙酸的生物合成途徑主要包括C4和C5途徑.對5-氨基乙酰丙酸的合成途徑和調(diào)控機(jī)制以及利用大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌通過C4途徑和C5途徑合成5-氨基乙酰丙酸的代謝工程研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述.

5-氨基乙酰丙酸；C4途徑；C5途徑；代謝工程

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物體合成葉綠素、血紅素和維生素B12等四吡咯類化合物的前體物質(zhì)，是一種廣泛存在于微生物、植物和動物細(xì)胞中的非蛋白類五碳氨基酸.近年來，ALA作為一種安全、選擇性和滲透性好的光動力學(xué)藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注.目前，ALA已經(jīng)應(yīng)用于諸多癌癥(如皮膚癌、消化道癌及肺癌等)的診斷與光動力學(xué)治療[1].作為第二代光動力學(xué)藥物的顯著優(yōu)點是副作用小、滲透性好和療效確切和對疾病的適用范圍廣等.同時，作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化農(nóng)藥，對農(nóng)作物和人畜無害，可在農(nóng)業(yè)上廣泛用作光動力學(xué)殺蟲劑、落葉劑和除草劑等[1-2].

目前主要采用化學(xué)合成法進(jìn)行ALA的工業(yè)化生產(chǎn)[3]，由于化學(xué)合成反應(yīng)步驟多、副產(chǎn)物多、分離提純難、ALA的得率低以及環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，生物法合成ALA已成為未來研究發(fā)展的趨勢[1].筆者介紹了5-氨基乙酰丙酸的合成途徑和調(diào)控機(jī)制以及通過C4途徑和C5途徑生物合成5-氨基乙酰丙酸的代謝工程研究進(jìn)展.

1 ALA的生物合成途徑及代謝調(diào)控

自然界中，ALA的合成主要存在兩條途徑[1]：一條是以琥珀酸為前體物稱為C4途徑[4]，另一條是以谷氨酸為前體物稱為C5途徑[5].C4途徑是由5-氨基乙酰丙酸合酶(5-aminolevulic acid synthase, ALAS)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA，該途徑主要存在于紫細(xì)菌屬等光合細(xì)菌、真菌以及動物體中.C5途徑是以谷氨酸為前體物經(jīng)過三步酶促反應(yīng)生成ALA[1]，谷氨酸由谷氨酰-tRNA合成酶(由gltX基因編碼)催化生成谷氨酰-tRNA；后者在谷氨酰-tRNA還原酶(由hemA基因編碼)催化下生成谷氨酸-1-半醛；再經(jīng)谷氨酸-1-半醛-氨基轉(zhuǎn)移酶(由hemL基因編碼)催化生成ALA，該途徑廣泛存在于植物、藻類以及細(xì)菌中.ALA可進(jìn)一步用于合成吡咯類化合物，因此ALA的合成是吡咯類化合物合成的限速步驟，ALA合成的關(guān)鍵酶ALAS受其下游代謝物血紅素的反饋抑制[4-5].ALA生物合成途徑為

近年來，隨著多種微生物基因組測序的完成以及基因重組技術(shù)的不斷完善，使得通過基因工程等手段獲得性狀優(yōu)良的ALA生產(chǎn)菌株已成為現(xiàn)實.目前，對生物法合成ALA的研究主要集中在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，大多集中在關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA合成酶酶活的增強(qiáng)，也不乏通過發(fā)酵過程控制和優(yōu)化發(fā)酵條件增加ALA的合成.

2 ALA產(chǎn)生菌選育的早期研究

早期主要是從自然界中篩選得到合成ALA的微生物.1970年，Beale等[6]篩選獲得一株能夠利用CO2積累ALA的小球藻(Chlorellavulgaris)，隨后相繼發(fā)現(xiàn)其他小球藻也具有合成積累ALA的能力[7-8].但由于藻類自身的特性決定了其積累ALA的濃度較低，此后對藻類合成ALA的研究逐漸減少.1987年，Sasaki等[9]篩選到一株類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)，通過人為添加ALA合成前體物琥珀酸和甘氨酸，ALA積累量達(dá)到0.26 g/L，隨后進(jìn)一步添加乙酸和丙酸，ALA質(zhì)量濃度可提高至0.55 g/L[10].

ALA在ALA脫水酶(HemB，由hemB基因編碼)的催化作用下轉(zhuǎn)化為膽色素原.研究發(fā)現(xiàn)乙酰丙酸是ALA脫水酶的競爭性抑制劑，因此，添加適量的乙酰丙酸能夠抑制ALA脫水酶的活性從而積累ALA，這一手段成為發(fā)酵優(yōu)化中的一個有效策略[11].另一個策略是通過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，菌株R.sphaeroidesCR 720的ALA積累量達(dá)到了3.61 g/L[12].但是發(fā)酵優(yōu)化的前提是獲得具有高效合成ALA潛力的菌株，又因從自然界篩選合成ALA的工業(yè)菌種工作量大且具有盲目性，致使ALA的生物合成研究進(jìn)展緩慢.隨著基因工程、代謝工程及組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究重點集中于ALA生產(chǎn)菌株的代謝工程改造.

3 利用C4途徑合成ALA

C4途徑是利用ALA合成酶通過一步酶促反應(yīng)催化中心代謝產(chǎn)物琥珀酰-CoA和甘氨酸縮合生成ALA，方法簡單.大腸桿菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)作為模式菌株，遺傳背景清晰，分子操作手段和工具完善齊備，因此目前利用C4途徑合成ALA主要集中于這兩種微生物.

3.1 大腸桿菌C4途徑合成ALA

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，模式微生物表達(dá)異源蛋白的策略被廣泛采用.而大腸桿菌作為一種具有諸多優(yōu)點(如遺傳背景清晰、遺傳操作工具完善、操作簡單、營養(yǎng)要求簡單等)的模式微生物常被研究者用作異源蛋白的表達(dá)載體.野生型的大腸桿菌利用C5途徑合成ALA，已有文獻(xiàn)報道C4途徑的重組大腸桿菌ALA最高產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了9.40 g/L[13].

Vander等[14]成功將來源于R.sphaeroides菌株中的hemA基因克隆至E.coli中，實現(xiàn)了hemA基因的異源活性表達(dá)以及ALA的異源生物轉(zhuǎn)化(表1).基于提高ALAS(5-氨基乙酰丙酸合酶)的表達(dá)量及活力，F(xiàn)u等[15]將來源于R.sphaeroides的hemA基因克隆至依賴于T7RNA聚合酶的表達(dá)系統(tǒng)中，并分析了其在E.coliBL21 (DE3)和E.coliRosetta (DE3)中的表達(dá)差異.研究發(fā)現(xiàn)，hemA基因在E.coliRosetta (DE3)菌株中得到了更好的表達(dá)，ALA 產(chǎn)量提高至3.80 g/L(表1).與此同時，多個研究團(tuán)隊嘗試了來源于不同菌株的hemA基因的表達(dá)，他們分別從大豆根瘤菌(Bradyrhzobiumjaponicum)[16-17]、放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)[18-20]和沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)[21]菌株中克隆hemA基因并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)分析.研究表明，不同來源的ALAS在E.coli中的活性差異較大(表1).

2013年，Zhang等[22]克隆了來源于R.palustris的ALAS同工酶基因hemA和hemO，最終通過過表達(dá)hemO使ALA產(chǎn)量達(dá)到了6.31 g/L(表1).

表1 大腸桿菌C4途徑合成ALA

3.2 谷氨酸棒桿菌C4途徑合成ALA

谷氨酸棒桿菌是一種革蘭氏陽性菌，抗逆能力較強(qiáng)，發(fā)酵性能穩(wěn)定.與大腸桿菌相比，谷氨酸棒桿菌不具有內(nèi)毒素，被認(rèn)為是具有安全性(Generally recognized as safe, GRAS)的微生物，因此被廣泛用于谷氨酸、賴氨酸等食用和藥用氨基酸的生產(chǎn).近年來人們陸續(xù)開始利用谷氨酸棒桿菌進(jìn)行ALA的合成，C4途徑因其代謝路徑簡單而成為研究熱點.

Feng等[23]以C.glutamicumATCC 13032作為出發(fā)菌株進(jìn)行代謝改造，為提高關(guān)鍵酶的表達(dá)量，異源表達(dá)來自R.palustris的hemA基因，并對其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其能夠在宿主菌株內(nèi)高效表達(dá).添加7.50 g/L的前體物甘氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得1.44 g/L ALA.隨后為加強(qiáng)中心代謝，增加丙酮酸的代謝通量并減少丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸和乙酸，敲除乳酸合成基因ldhA和乙酸合成基因pqo.此外，為減少乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為乙酸，敲除乙酸合成基因pta，ackA及cat，并過表達(dá)編碼乙酸合成乙酰-CoA的acsA基因，以增加乙酰-CoA的供應(yīng).結(jié)果顯示，乙酸含量減少了58%，而ALA僅有0.65 g/L，暗示過量的乙酰-CoA可能會對ALA的合成具有反作用.此外，為增加ALA的外排，減弱底物抑制和毒害作用，分別敲除與細(xì)胞壁合成有關(guān)的高分子量青霉素結(jié)合蛋白編碼基因pbp1a，pbp1b，pbp2a和pbp2b.結(jié)果表明敲除pbp1b后，目的產(chǎn)物ALA的積累量達(dá)到2.68 g/L，提高了29.5%.在此基礎(chǔ)上過表達(dá)來源于E.coli的ALA運輸載體編碼基因rhtA.利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗證，流加4.60 g/L甘氨酸發(fā)酵33 h后，ALA的積累量為7.53 g/L.

Yang等[24]以C.glutamicumCgS1為出發(fā)菌株，過表達(dá)來源于不同菌株的ALAS，結(jié)果表明來源于R.capsulatus32 SB1003的ALAS具有較高的合成ALA的潛能.CgS1/pEC-SB菌株在5 L發(fā)酵罐中采用流加培養(yǎng)的方式，ALA積累量達(dá)到7.60 g/L.

雖然利用C4途徑合成ALA的方法簡單且較為有效，但微生物細(xì)胞在生長過程中額外消耗底物甘氨酸，造成ALA合成效率低，更重要的是甘氨酸對細(xì)胞具有毒害作用[14]，進(jìn)一步影響了其工業(yè)化生產(chǎn)的前景.

4 利用C5途徑合成ALA

C4途徑合成ALA需要在培養(yǎng)過程中添加前體物琥珀酸和甘氨酸，與C5途徑以葡萄糖為碳源合成ALA相比，不僅極大地增加了成本，而且甘氨酸對于細(xì)胞生長具有抑制作用，阻礙了C4途徑合成ALA的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展.因此，對于利用C5途徑合成ALA的研究日益增多.

4.1 大腸桿菌C5途徑合成ALA

Kang等[25]首次通過改造E.coliALA合成C5途徑，實現(xiàn)了在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源一步發(fā)酵生產(chǎn)ALA的設(shè)想.研究發(fā)現(xiàn)由hemA基因編碼的谷氨酰-tRNA還原酶以及由hemL基因編碼的谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶是C5途徑的限速酶，兩者存在協(xié)同作用.通過單獨表達(dá)hemA，以及共表達(dá)hemA和hemL使得ALA產(chǎn)量分別提高5.7倍和66倍.

此外，許多用于轉(zhuǎn)運氨基酸的潛在轉(zhuǎn)運蛋白已經(jīng)被預(yù)測[26]，且在ALA代謝工程改造中被加以應(yīng)用[27].為尋找高效的ALA轉(zhuǎn)運蛋白，研究者對蛋白運輸載體YeaS[28](亮氨酸胞外轉(zhuǎn)運蛋白，由yeaS基因編碼)以及RhtA[29](蘇氨酸和高絲氨酸胞外轉(zhuǎn)運蛋白，由rhtA基因編碼)進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，RhtA轉(zhuǎn)運蛋白對ALA具有較強(qiáng)的運輸能力，通過共表達(dá)rhtA基因，ALA的產(chǎn)量提高了約46%.

張良程等[30]以ALA高產(chǎn)菌株大腸桿菌E.coliZDEcA8為出發(fā)菌株，以活性喪失但能正常表達(dá)的ALA合成酶突變體大腸桿菌作為對照，通過不同基因轉(zhuǎn)錄組的測定，對潛在的ALA轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行研究.已有文獻(xiàn)報道rhtA過表達(dá)可以提高ALA的產(chǎn)量，促進(jìn)胞內(nèi)ALA的外排.EamA與RhtA屬于同一個轉(zhuǎn)運蛋白家族，并且屬于同源蛋白，推測EamA也參與ALA的向外轉(zhuǎn)運.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，這兩個基因的表達(dá)都沒有發(fā)生顯著差異，推測這兩個基因不受ALA的誘導(dǎo).該研究鑒定出RhtA，EamA和EmrD等為ALA轉(zhuǎn)運蛋白，可對其進(jìn)行深入研究，探索其轉(zhuǎn)運機(jī)制、轉(zhuǎn)運活性和底物親和性等.

4.2 谷氨酸棒桿菌C5途徑合成ALA

Yu等[31]首次報道谷氨酸棒桿菌具有ALA C5合成途徑，并證明谷氨酸棒桿菌能夠合成ALA.為增加關(guān)鍵酶的酶活，共表達(dá)了來源于Salmonellaarizona的hemA基因和來源于大腸桿菌的hemL基因.為抑制ALA代謝為血紅素，在發(fā)酵的時候添加抑制劑乙酰丙酸、馬來酸和硝基苯甲酸.此外，還對培養(yǎng)基中Fe2+的濃度和轉(zhuǎn)速進(jìn)行了優(yōu)化.最后，在5 L生物反應(yīng)器中積累了1.79 g/L的ALA.該研究首次證明了谷氨酸棒狀桿菌能夠通過C5途徑合成ALA，為后續(xù)代謝工程育種提供了依據(jù).

Ramzi等[32]以C.glutamicumATCC 13032為出發(fā)菌株，比較了過表達(dá)不同來源的hemA對ALA合成的影響，結(jié)果表明源于S.typhimurium的hemA表達(dá)效果最好(204 mg/L)，隨后又共表達(dá)了hemA和hemL基因，ALA積累至457 mg/L，兩者分別為出發(fā)菌株(17 mg/L)的11.6倍和25.9倍.隨后在添加谷氨酸的條件下，搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)產(chǎn)量達(dá)到2.20 g/L.

Yu等[33]在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)異源hemA和hemL，測定了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平.轉(zhuǎn)錄組分析表明糖酵解途徑受到抑制，三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑和氧化呼吸鏈增強(qiáng).轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)HrrSA參與血紅素合成的調(diào)控.而ALA作為血紅素合成的前體物，其積累有助于血紅素合成和呼吸代謝.當(dāng)血紅素存在的時候，HrrSA能夠促進(jìn)血紅素的降解.HrrSA激活了hmuO的表達(dá)(hmuO編碼血紅素氧化酶)，同時，HrrSA能夠激活含有血紅素并且與呼吸鏈有關(guān)的組件，抑制與血紅素合成有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，hrrA和hrrS全部上調(diào)，抵消了heme的積累.

5 結(jié) 論

近年來，通過C4和C5途徑生物合成ALA均取得了較為長足的進(jìn)展，為后續(xù)研究提供了必要的依據(jù)，奠定了堅實的基礎(chǔ)，并且加快了其工業(yè)化的進(jìn)程.但是，C5途徑合成ALA相較C4途徑而言合成途徑更長，并且關(guān)鍵酶HemA的催化反應(yīng)需要還原力NADPH.因此，如何增加反應(yīng)體系的還原力也將是后續(xù)研究重點.隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究的迅猛發(fā)展，對谷氨酸棒桿菌合成ALA轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的研究也將成為熱門并可為其代謝工程改造提供依據(jù).此外，隨著CRISPR interference技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用[34]，利用該技術(shù)對ALA脫水酶編碼基因hemB的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行干擾以減少ALA的分解也將成為研究的熱點.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Advance on biosynthesis of 5-aminolevulinic acid

LI Zhixiang1, ZHAO Lei1, LIANG Yunlong1, ZHANG Chenglin1,2,3

(1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 3.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China)

As the key intermediate for biosynthesis of tetrapyrrole compounds, such as heme and chlorophyll, 5-aminolevulinic acid (ALA) is widely used in agriculture and pharmaceutical field. There are mainly two pathways for ALA biosynthesis found in microorganisms, C4 and C5 pathway. In this review, metabolic engineering and fermentation engineering research on ALA biosynthesis byEscherichiacoliandCorynebacteriumglutamicumvia C4 and C5 pathway was summarized.

ALA; C4 pathway; C5 pathway; metabolic engineering

2017-04-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(31300069)；天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金(2016LG07)；天津市科委科技特派員項目(15JCTPJC62800)；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201710057039)

李智祥(1991—)，男，山東日照人，碩士研究生，研究方向為5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株代謝工程育種，E-mail: 415323662@qq.com.通信作者：張成林副教授，E-mail: zcl@tust.edu.cn.

TQ922

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1674-2214(2017)03-0178-05