駱峻，路美玲，王成，夏正坤，張春妮

(1．江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院中心實驗室，南京 210029; 2.南京總醫(yī)院a.檢驗科，b. 小兒科，南京 210002)

·臨床實驗研究·

腎病綜合征患兒腎活檢組織miRNA檢測及意義*

駱峻1，路美玲2a，王成2a，夏正坤2b，張春妮2a

(1．江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院中心實驗室，南京 210029; 2.南京總醫(yī)院a.檢驗科，b. 小兒科，南京 210002)

目的 分析腎病綜合征患兒腎活檢組織miRNA的表達水平，并探討其作為區(qū)分腎病病理亞型潛在標志物的可能性。方法 收集腎病綜合征患兒腎組織活檢標本41例，包括系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)22例、微小病變(MCD)8例和毛細血管內增生性腎小球腎炎(ECPGN)11例，以8例無腎功能不全的成人腎組織為對照組。RT-qPCR檢測各組腎組織中miR-191、miR-151-3p、miR-150、miR-19b和miR-30a-5p的表達水平，并分析其與腎功能相關臨床指標的相關性。結果 與正常腎組織相比，腎病綜合征患兒腎組織中miR-191明顯上調(P<0.01)，miR-151-3p明顯下調(P<0.01)。此外，MCD組miR-150表達水平明顯低于對照組、MsPGN組和ECPGN組(P均<0. 05)。 miRNA在腎組織中的表達與臨床血清學指標IgG、TP和Cr均呈正相關，與TC呈負相關(P均<0.05)。結論 miRNA在腎病綜合征患兒腎組織中的表達與病理分型有關，miR-150具有潛在區(qū)分腎病患兒MCD型與其他亞型的鑒別診斷價值。

微小核糖核酸；腎活檢；腎病綜合癥；兒童

腎活檢是確定腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)病理類型的金標準，對指導臨床治療具有至關重要的作用[1]。研究表明，miRNA與多種臨床疾病相關[2]，其中，在腎臟發(fā)育、新陳代謝和腎功能障礙、損傷過程中起重要作用[3]。另有研究表明，腎小球損傷的成人腎組織中一些特定miRNA表達失調[4]，而在腎病患兒腎組織中的表達水平的相關研究極少。本課題組前期研究[5]發(fā)現，腎病綜合征患兒血清miRNA的表達水平與健康人對照組差異有統(tǒng)計學意義，其中miR-191、miR-151-3p、miR-150、miR-30a-5p和miR-19b的表達水平均明顯升高。本研究通過檢測該5種miRNA在腎病綜合征患兒腎組織中的表達水平，以期進一步分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象及標本采集 收集2013年1-6月在南京總醫(yī)院小兒科就診的腎病綜合征患兒腎活檢組織樣本41例，男23例、女18例，年齡(8.3±2.9)歲。根據1995年WHO修訂的第二版標準文件對腎小球疾病進行病理分型[6]，其中系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)22例、微小病變(minimal change disease, MCD)8例和毛細血管內增生性腎小球腎炎(endocapillaryproliferative glomerulonephritis, ECPGN)11例。納入標準：(1)臨床明確診斷為各類型原發(fā)性腎小球腎炎腎病綜合征患兒;(2)年齡不超過14周歲;(3)腎活檢病理分型屬于本研究涉及的3種病理類型。與急性感染性腎炎、代謝性腎疾病、腎細胞癌等進行鑒別診斷，并予以排除?；純盒心I活檢前均經過一定療程臨床藥物治療。收集同期就診的8例無腎功能不全的成人腎組織(從用于診斷目的腎活檢剩余或腎切除術中獲得)作為對照組，男5例、女3例，年齡(53.9±13.6)歲，均經病理診斷無腎臟組織細胞病變。所有受試者的組織樣本獲取后立即用液氮冷凍，使用前置-80 ℃保存。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，患者父母知情同意。

1.2 儀器與試劑 7500型qRT-PCR儀、2720型PCR儀(美國ABI公司)；7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)；CP全自動化學發(fā)光免疫分析儀及配套試劑(德國西門子公司)；1612-1型高速離心機(上海醫(yī)療器械公司)；5418型高速冷凍離心機、分光光度計(德國Eppendorf公司)；SAS67120型超純水機(美國Millipore公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；氯仿、異丙醇及無水乙醇(上?；瘜W試劑公司)；DEPC處理的ddH2O(南京凱基公司)；逆轉錄反應試劑、qRT-PCR反應體系(大連TaKaRa公司)；TaqMan探針試劑(美國ABI公司);生化試劑盒(英國Randox公司)。

1.3 腎功能相關臨床指標的測定 按照全自動生化分析儀及相應的生化試劑盒說明書操作測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、總蛋白(TP)、清蛋白(Alb)、肌酐(Cr)、尿素(Ure)和尿酸(UA)的含量。尿微量清蛋白(uAlb)采用免疫比濁法測定。比濁法測定免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)及免疫球蛋白E(IgE)的濃度。補體C3、C4用全自動化學發(fā)光免疫分析儀測定。以上檢測參數均由儀器直接輸出檢測結果。

1.4 RNA提取及miRNA的測定

1.4.1 組織RNA提取 取組織樣本研磨，每100 mg組織樣本中加入1 mL Trizol試劑，用氯仿震蕩混勻，冰上靜置10 min，4 ℃、16 000×g離心20 min，收集上清液；加入與上清等體積的異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃靜置1～2 h，4 ℃、12 000×g離心20 min；留沉淀，加入1 mL 75%DEPC-乙醇，渦漩混勻，4 ℃、12 000×g離心20 min。留沉淀，待干燥后加20 μL DEPC處理的ddH2O至RNA完全溶解，測定RNA濃度及純度(A260/280 nm),取吸光度1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實驗。將RNA濃度調至0.5 μg/μL，置-80 ℃保存。

1.4.2 引物設計及逆轉錄反應 針對每種miRNA，由美國ABI公司設計并合成1個具有相同莖環(huán)結構的基因特異性反向引物[7]。按照逆轉錄試劑盒說明書操作將DNA逆轉錄為cDNA，cDNA樣本置-20 ℃保存。

1.4.3 RT-qPCR反應 采用基于TaqMan探針的qRT-PCR方法檢測miR-30a-5p，RT-qPCR反應體系試劑盒由TaKaRa公司提供，TaqMan探針由美國ABI公司提供，儀器使用ABI 7500 PCR儀，實驗方法參照參考文獻[7]。PCR循環(huán)參數：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。以U6作為內參照。腎病綜合征患兒標本相對于對照組標本中miRNA的變化倍數用2-ΔCt法計算。試驗重復3次。

2 結果

2.1 各組患兒腎功能臨床參數比較 3種病理亞型的腎病綜合征患兒血清IgG、IgA、C3、C4、TC、TP、Alb、UA和uAlb濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，而在年齡、血清中IgM、IgE、TG、Ure和Cr濃度差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 不同病理亞型腎病綜合征患兒腎組織中miRNA表達水平比較 與對照組相比，3組腎病亞型中miR-191均明顯上調(P<0.05)，而miR-151-3P均明顯下調(P<0.01)。MCD組患兒miR-150表達水平明顯低于對照組、MsPGN組和ECPGN組(P均<0.05)。MsPGN組患兒miR-19b表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表1 不同病理亞型腎病綜合征患兒臨床腎功能指標比較

注：與MsPGN組比較，*，P<0.05；與MCD組比較，#，P<0.05。

表2 不同病理亞型腎病綜合征患兒腎組織miRNA表達水平(2-ΔCt值)

注： 與對照組比較，#，P<0.05；與MsPGN組比較，△，P<0.05；與MCD組比較，◇，P<0.05。

2.3 miRNA與腎病綜合征患兒臨床腎功能指標的相關性分析 miR-191表達水平與IgG和TP呈正相關(P均<0.05)；miR-151-3p表達水平與TP呈正相關(P<0.05)；miR-150表達水平與IgG、TP和Cr呈正相關(P<0.05)，與TC呈負相關(P<0.05)；miR-30a-5p表達水平與TP呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 腎病綜合征患兒腎組織中miRNA表達與臨床參數的相關性

3 討論

王燕等[8]研究發(fā)現腎病綜合征患兒血清中miR-151-3p表達水平升高，而經臨床治療好轉后表達水平下降，與本研究結果較為一致，提示miR-151-3p可能與腎病綜合征患兒臨床表征或腎小球損傷程度有關。miR-191是N-脫乙?；? N -磺基轉移酶1(NDST1)的作用靶點，該酶在腎組織中存在特異性表達，而NDST1基因敲除小鼠腎基底膜發(fā)生結構和功能異常[9]，提示miR-191在維持基底膜正常生理功能方面具有潛在的研究價值。本研究發(fā)現miR-19b在MsPGN組表達上調，而胡佳等[10]研究提示腎癌的發(fā)生可能與miR-19b-1上調有關。Wu等[11]發(fā)現miR-30a-5p和miR-30家族其他成員在腎病患者足細胞中下調，促進足細胞損傷，并進一步證實miR-30通過靶向作用于Notch1和p53來保護足細胞，但本研究中miR-30a-5p表達水平未見明顯異常。

本研究還發(fā)現miR-150在MCD患者的腎內表達水平明顯低于對照組和其他腎病亞型；Zhou等[12]發(fā)現miR-150過表達可以促進腎間質纖維化，表明miR-150可能作為一種潛在的生物學標志物定量狼瘡性腎炎腎損傷。此外，miR-151-3p和miR-150可調節(jié)降鈣素受體(CALCR)和叉頭蛋白P1(FOXP1)，該兩者參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程[13]。一般來說，腎臟疾病往往始于腎小球損傷，導致腎小管間質損傷，后者通常表現為腎小球系膜細胞、內皮細胞和足細胞的損傷，最終導致腎功能異常[14]。MCD是腎病患兒綜合征最常見的形式，但在病變未出現腎小球硬化和間質纖維化時，往往不能與其他類型的腎小球疾病區(qū)分[15]。本研究結果提示腎組織miR-150表達水平可能是一個潛在的區(qū)分MCD和其他腎病亞型的指標。

此外，本研究還通過Spearman相關系數分析發(fā)現miRNA與部分臨床常用血清學指標明顯相關，尤其是腎內miR-150水平與IgG、TC、TP、Cr相關性顯著，提示miR-150與臨床腎功能血清學指標聯合檢測可能會更好的對腎病兒童MCD亞型進行臨床鑒別診斷。此外，值得注意的是血清TP指標與miR-150、miR-191、miR-151-3p、miR-30a-5p均呈現良好的正相關性，其機制尚待進一步探討。

本研究存在一些不足之處，如各組患者樣本量較少，因無法獲得正常兒童腎組織對照而只能采用成人腎組織作為對照組，未考慮不同種族間miRNA表達的差異性[16]等因素。因此，尚沒有足夠的統(tǒng)計學證據以得出確證的結論。但量化腎病綜合征患兒腎組織中miRNA的表達水平是一項新穎而有意義的研究。總之，本研究發(fā)現腎病患兒患者腎組織中miR-191、miR-151-3p、miR-150及miR-19b表達失調。這些miRNA在腎組織中異常表達可能與腎病患兒發(fā)病機制有關。miR-150具有潛在的區(qū)分MCD與其他亞型的鑒別診斷價值。

[1]Zhou TB,Lin N,Qin YH,etal. Distribution of pathological finding in the children with nephrotic syndrome from Guangxi[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2014,25 (3):684-688.

[2]Ho J, Kreidberq JA. MicroRNAs in renal development[J]. Pediatr Nephrol, 2013,28(2):219-225.

[3]Sui W,Lin H,Li H,etal. Circulating microRNAs as potential biomarkers for nephrotic syndrome[J]. Iran J Kidney Dis, 2014,8(5):371-376.

[4]Teng J,Sun F,Yu PF,etal. Differential microRNA expression in the serum of patients with nephrotic syndrome and clinical correlation analysis[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(6):7282-7286.

[5]Luo Y,Wang C,Chen X,etal. Increased serum and urinary microRNAs in children with idiopathic nephrotic syndrome[J]. Clin Chem, 2013,59(4):658-666.

[6]鄒萬忠．腎活檢病理診斷標準指導意見[J]．中華腎臟病雜志, 2001,17(4):270-275．

[7]Yang C,Wang C,Chen X,etal. Identification of seven serum microRNAs from a genome-wide serum miRNA expression profile as potential noninvasive biomarkers for malignant astrocytomas[J]. Int J Cancer, 2013,132(1):116-127.

[8]王燕,甘世偉,胡禮儀. miR-151-3p在原發(fā)性腎病綜合征患兒血清中的表達及臨床意義[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2014,36(6):600-603.

[9]Chaturvedi P,Chen NX,O′Neill K,etal. Differential miRNA expression in cells and matrix vesicles in vascular smooth muscle cells from rats with kidney disease[J]. PLoS One, 2015,10(6):e0131589.

[10]胡佳,金露,何韜,等. miR-19b-1在腎癌中的表達及臨床意義的研究[J]. 現代泌尿外科雜志, 2016,21(3):222-225.

[11]Wu J,Zheng C,Fan Y,etal. Downregulation of microRNA-30 facilitates podocyte injury and is prevented by glucocorticoids[J]. J Am Soc Nephrol, 2013,25(1):92-104.

[12]Zhou H,Hasni SA,Perez P,etal. miR-150 promotes renal fibrosis in lupus nephritis by downregulating SOCS1[J]. J Am Soc Nephrol, 2013,24(7):1073-1087.

[13]Tang B,Becanovic K,Desplats PA,etal. Forkhead box protein p1 is a transcriptional repressor of immune signaling in the CNS: implications for transcriptional dysregulation in Huntington disease[J]. Hum Mol Genet, 2012,21(14):3097-3111.

[14]Abdel Gawad ER,Mansour AI,Abdel Aziz YA,etal. Role of anti-nucleosome antibodies in the diagnosis of systemic lupus erythematosus and as a marker for lupus nephropathy[J]. Egypt J Immunol, 2014,21(1):57-65.

[15]Weening JJ,Ronco P,Remuzzi G. Advances in the pathology of glomerular diseases[J]. Contrib Nephrol, 2013,181:12-21.

[16]時永輝,王成,閆巖,等. 藏族和漢族健康人群血漿miRNA表達譜的差異[J]. 臨床檢驗雜志,2017,35(3):175-177.

(本文編輯：許曉蒙)

Detection of miRNA in kidney biopsies of child patients with nephrotic syndrome and its significance

LUOJun1,LUMei-ling2a,WANGCheng2a,XIAZheng-kun2b,ZHANGChun-ni2a

(1.CentralLaboratoryofJiangsuHealthVocationalCollege,Nanjing210029,Jiangsu; 2a.DepartmentofClinicalLaboratory, 2b.DepartmentofPediatry,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China)

Objective To investigate the expression levels of miRNA in kidney biopsies of child patients with nephrotic syndrome and the possibility of miRNA as potential markers in differentiating the pathologic subtypes of nephrosis. Methods Kidney biopsy specimens from 41 child patients with nephrotic syndrome, including 22 with mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN), 8 with minimal change disease (MCD) and 11 with endocapillary proliferative glomerulonephritis (ECPGN), were collected, and adult nephridial tissues from 8 patients without renal inadequacy were selected as controls. The expression levels of miR-191, miR-151-3p, miR-150, miR-30a-5p and miR-19b in nephridial tissues were detected by RT-qPCR, and their correlations with renal function related parameters were analyzed. Results Compared with the controls, the miR-191 levels in kidney tissues of child patients with nephrotic syndrome increased significantly (P<0.01), while the miR-151-3p levels decreased obviously (P<0.01). The expression levels of miR-150 in MCD patients were significantly lower than those in MsPGN and ECPGN patients and the controls (P<0.05). The expression levels of these miRNAs were positively correlated with serum IgG, TP and Cr levels, but negatively with serum TC levels (P<0.05). Conclusion The expression levels of miRNA in kidney tissues of child patients with nephrotic syndrome are related to pathological typing of nephrosis, and miR-150 may be a potential marker which may differentiate MCD from other subtypes of nephrosis.

microRNA; kidney biopsy; nephrotic syndrome; children

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.10

國家自然科學基金(81472021);南京總醫(yī)院基金(2012041)。

駱峻，1974年生，男，副主任技師，高級實驗師，碩士，主要從事醫(yī)學檢驗教研工作。

張春妮，主任技師，博士，E-mail：zchunni27@hotmail.com。

R692

A

2017-06-07)