朱紅艷，牛華，符浩，鄭永欽，孟強(qiáng)

(1.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.神經(jīng)內(nèi)科，c.臨床基礎(chǔ)研究所，昆明 650032；3.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650032)

·研究生園地·

大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧模型中內(nèi)參基因的選擇*

朱紅艷1,2a,3，牛華2a，符浩2b，鄭永欽2c，孟強(qiáng)2b

(1.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.神經(jīng)內(nèi)科，c.臨床基礎(chǔ)研究所，昆明 650032；3.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650032)

目的 篩選大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)模型中合適的內(nèi)參基因。方法 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測3種常用管家基因：3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)、核糖體蛋白L13A(RPL13A)在大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平；并采用GeNorm程序分析得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。結(jié)果RPL13A、GAPDH、ACTB基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值(M值)分別為0.590、0.570、0.397。結(jié)論 在大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞OGD/R模型中表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是RPL13A，最穩(wěn)定內(nèi)參基因是ACTB。

內(nèi)參基因；GeNorm程序；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；氧糖剝奪/復(fù)氧模型；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中廣泛用來檢測基因表達(dá)的一種常用方法。但是在實(shí)際研究過程中，由于易受到細(xì)胞數(shù)量、標(biāo)本大小、不同實(shí)驗(yàn)條件的影響，必須使用內(nèi)參基因進(jìn)行校正才能獲得更為真實(shí)可信的結(jié)果。由于管家基因在不同的物種，不同組織和不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)也具有特異性，其表達(dá)的穩(wěn)定性是相對的。因此，研究者需要根據(jù)自己的樣品類型和實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的管家基因作為內(nèi)參基因。氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprive/reoxygenation, OGDR)模型是常用的體外研究腦缺血再灌注模型。本研究旨在篩選最合適的大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelia cells, BMECs )OGD/R模型中內(nèi)參基因。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6只新生SD大鼠乳鼠，日齡3～5 d，購于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物試驗(yàn)遵守國家相關(guān)條例規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器 EastepTM總RNA 提取試劑盒(LS1030)，Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5000)購自上海普洛麥格公司，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(RR820A, 大連寶生物公司);Nanodrop2000分光光度計(jì)、梯度PCR儀(美國Thermo scientific公司),LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國Roche公司),Forma 3131 三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和氧糖剝奪/復(fù)氧模型 原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟參照Burek等[1]的方法并稍作改進(jìn)：常規(guī)培養(yǎng)并傳代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(消化用酶為0.2% Ⅳ型膠原酶和0.2%中性蛋白酶各3 mL)。取生長狀態(tài)良好的第3～4代細(xì)胞，按1×105/mL細(xì)胞密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)氧糖剝奪(OGD)組：培養(yǎng)基換成無糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)(94% N2，5% CO2，1% O2)1、2、3、6、24 h；氧糖剝奪/復(fù)氧(OGDR)組：先按上述條件低氧培養(yǎng)2 h后恢復(fù)正常氧濃度，再用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1、2、3、6、24 h；選取與上兩組一致的同一代細(xì)胞按正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)后作為正常對照組。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 cDNA合成 參照EastepTM總RNA(LS1030)提取試劑盒說明書操作提取細(xì)胞總RNA。用Nanodrop2000分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.1間的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RNA和cDNA樣本均置于-80 ℃保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列見表1。參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR總反應(yīng)體系為20 μL,包括SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。循環(huán)參數(shù)： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃，1個(gè)循環(huán)； 50 ℃ 30 s。經(jīng)LightCycler 480配套軟件對各管家基因的循環(huán)閾值(Ct值)和熔解曲線進(jìn)行分析。結(jié)果判讀：先找出某一管家基因Ct值最小者(該樣本基因表達(dá)量為1)，求出各樣本該管家基因△Ct，△Ct=各樣本Ct-最小者Ct值，然后求出各樣本該管家基因的相對表達(dá)量(2-△Ct值)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 從GeNorm官網(wǎng)下載GeNorm程序程序，并將這些數(shù)值導(dǎo)入程序，計(jì)算每個(gè)基因的穩(wěn)定性即平均值(M)(每行代表1個(gè)樣品，列是待選內(nèi)參基因， M值越小，表達(dá)度越穩(wěn)定)，以M值對管家基因的表達(dá)度進(jìn)行排序，選擇M值最高的管家基因，點(diǎn)擊刪除，軟件重新計(jì)算剩下基因的穩(wěn)定性，以此類推，直到在計(jì)算陣列中僅剩2個(gè)基因，這2個(gè)基因就是表達(dá)最穩(wěn)定的基因[2]。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果ACTB、RPL13A和GAPDH3種管家基因的Ct值均為10～16，熔解曲線示3種管家基因熔解峰單一，表明PCR擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。見圖1。

2.2 3種基因表達(dá)穩(wěn)定度 GeNorm程序計(jì)算得到的RPL13A、GAPDH、ACTB基因的M值分別為0.590、0.570、0.397。ACTB基因M值最小，故而是模型中表達(dá)最穩(wěn)定的基因。

3 討論

在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化中，內(nèi)參基因的選擇是一個(gè)重要的部分。理想狀態(tài)下管家基因的表達(dá)應(yīng)該不受試驗(yàn)條件或不同的組織、細(xì)胞的影響，然而，這樣的基因尚未被發(fā)現(xiàn)[3]。目前尚無適合于所有體系作為內(nèi)參的管家基因，因此，研究者需根據(jù)試驗(yàn)樣品類型和條件來選擇合適的內(nèi)參基因。

GeNorm是Vandesompele等[2]開發(fā)的基于微軟Excel平臺的VBA宏程序，特別為內(nèi)參基因的選擇而設(shè)計(jì)，以被廣泛驗(yàn)證，并成功應(yīng)用于多項(xiàng)研究[4]。該程序通過計(jì)算某一管家基因與其他所有基因間兩兩比值的對數(shù)轉(zhuǎn)換值的平均變異度(M)值作為基因穩(wěn)定性的評價(jià)指標(biāo)，M值越小表明其越穩(wěn)定[5]。通過GeNorm計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)，在本研究中RPL13A最不穩(wěn)定，ACTB是在所分析3個(gè)基因中表達(dá)最穩(wěn)定的，GAPDH處于兩者之間。ACTB是一種細(xì)胞骨架蛋白，存在于所有的真核細(xì)胞中且高度保守[6]，有報(bào)道稱在大鼠心肌梗死模型中ACTB表達(dá)最不穩(wěn)定[5]，結(jié)果與本研究存在較大的差異，分析原因可能是因?yàn)檫x取的組織細(xì)胞來源不同所致。GAPDH是糖酵解、糖異生過程中的關(guān)鍵酶。Zhong等[7]研究證實(shí)在缺氧條件下GAPDHmRNA表達(dá)量增加，不適合作為內(nèi)參基因。另有研究發(fā)現(xiàn)，7個(gè)管家基因：GAPDH，RPS4X，RPLl3A，RNPSl，EEFlAl，TPTl，SRPl4中GAPDH是表達(dá)最不穩(wěn)定的[8]。在本研究中，GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性處于ACTB和RPL13A之間。不同研究獲得的矛盾結(jié)論可能與樣本和實(shí)驗(yàn)條件的不同有關(guān)。因此，在qRT-PCR分析中首先必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件確定合適的內(nèi)參基因。但因?qū)嶒?yàn)條件所限，本研究所選的內(nèi)參基因數(shù)量略少，一般文獻(xiàn)都推薦同時(shí)選5至6個(gè)以上管家基因同時(shí)篩選得到試驗(yàn)所選最佳內(nèi)參基因。今后，我們將擴(kuò)大管家基因的數(shù)量，并進(jìn)行進(jìn)一步的研究證實(shí)。

注：A,GAPDH擴(kuò)增曲線;B，GAPDH熔解曲線；C,ACTB擴(kuò)增曲線;D,ACTB熔解曲線;E,RPL13A擴(kuò)增曲線;F,RPL13A熔解曲線。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析各基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線

[1]Burek M, Salvador E, Forster CY. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model[J]. J Vis Exp, 2012，66:e4022.

[2]Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F,etal. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biol, 2002,3(7):H34.

[3]Liu DW, Chen ST, Liu HP. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall cell lung cancer[J]. Eur Respir J, 2005,26(6):1002-1008.

[4]Zhang X, Ding L, Sandford AJ. Selection of reference genes for gene expression studies in human neutrophils by real-time PCR[J]. BMC Mol Biol, 2005,6:4.

[5]趙傳艷, 王昕, 張春亮, 等. 大鼠心肌梗死模型中管家基因的選擇[J]. 國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志, 2013,36(4):216-219.

[6]董恩妮, 梁青, 李利, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇[J]. 中國畜牧雜志, 2013,49(11):92-96.

[7]Zhong H, Simons JW. Direct comparison ofGAPDH, beta-actin, cyclophilin, and 28S rRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999,259(3):523-526.

[8]Pilbrow AP, Ellmers LJ, Black MA,etal. Genomic selection of reference genes for real-time PCR in human myocardium[J]. BMC Med Genomics, 2008,1:64.

(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.21

國家自然科學(xué)基金(81460188)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng))(2013FB201)；云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才(2012HB028)；云南省衛(wèi)生系統(tǒng)學(xué)科帶頭人(D-201235)；王隴德院士工作站。

朱紅艷，1980年生，女，主管技師，博士研究生，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作。

孟強(qiáng)，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:mq301@sina.com.cn。

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2017-05-07)