馬蘭英，王華，唐勇

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830000)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

Keap1與食管鱗狀上皮細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度的關(guān)系

馬蘭英1，王華2，唐勇1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830000)

目的 分析Keleh樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keleh-like ECH-associated protein 1，Keap1)的表達(dá)水平與食管鱗狀上皮細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度的關(guān)系。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)ESCC患者的癌組織和癌旁組織中Keap1的表達(dá)水平，通過(guò)單因素和多因素分析及趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)分析其與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度的關(guān)系。結(jié)果 Keap1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=3.945，95%CI：1.485～9.147)和浸潤(rùn)深度(OR=4.683，95%CI：1.692～10.275)有關(guān)；Keap1高表達(dá)是ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(Waldχ2=23.579，P<0.01)，趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)隨Keap1表達(dá)水平的升高而升高(χ2=5.173，P=0.023)；Keap1的表達(dá)是ESCC侵及漿膜的危險(xiǎn)因素(Waldχ2=26.587，P<0.01)，趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ESCC侵及漿膜的風(fēng)險(xiǎn)隨Keap1表達(dá)水平的升高而升高(χ2=9.788，P=0.002)。結(jié)論 Keap1的表達(dá)與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，Keap1的表達(dá)可促進(jìn)ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。

Keleh樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1；食管鱗狀上皮細(xì)胞癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；浸潤(rùn)深度；單因素分析；多因素分析；趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)

Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路是機(jī)體抗氧化應(yīng)激和損傷的重要調(diào)節(jié)通路，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答，其主要由Keleh樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keleh-like ECH-associated protein 1，Keap1) 和核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)等組成[1]。研究顯示，Keap1在肺癌、前列腺癌、胃癌、喉癌、卵巢癌和食管鱗狀上皮細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)等組織中的表達(dá)存在異常，提示其可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2-5]。針對(duì)ESCC的研究顯示，Keap1在癌組織中的陽(yáng)性率明顯高于正常食管黏膜組織[5]?；诖?，本研究擬檢測(cè)ESCC癌組織和癌旁組織中Keap1的表達(dá)水平，明確其與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，并進(jìn)一步分析其與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度的關(guān)系，以期探討Keap1在ESCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 以2011年3月至2016年3月于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除且臨床資料完備的196例ESCC患者為研究對(duì)象，男104例，女92例，年齡34～76歲，中位年齡60歲，均來(lái)自新疆及周邊地區(qū)；納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診的ESCC初治患者；(2)均進(jìn)行手術(shù)切除；(3)手術(shù)切除前均未進(jìn)行放、化療；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并第2原發(fā)癌的患者；(2)患有乙肝、丙肝和梅毒等傳染病的患者；(3)因其他原因存在肝功損害的患者；(4)不同意參加本研究的患者。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者113例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者83例；高中分化鱗狀上皮細(xì)胞癌156例，低分化鱗狀上皮細(xì)胞癌40例。采集各研究對(duì)象的癌組織，并隨機(jī)選取31例患者的癌旁食管組織(距離癌組織5 cm以上,且經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞)為對(duì)照組，男16例，女15例，年齡34～74歲，中位年齡59歲；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例；高中分化鱗狀上皮細(xì)胞癌25例，低分化鱗狀上皮細(xì)胞癌6例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人Keap1多克隆抗體(BA4479-1，武漢博士德公司)，通用型SP試劑盒(PV-9000)和DAB顯色劑(ZLI-9018)購(gòu)自北京中杉金橋公司，BX46光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組化SP法檢測(cè) ESCC癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm的厚度切片。石蠟切片于60 ℃恒溫箱中烘烤20 min，用二甲苯浸泡25 min進(jìn)行脫蠟；無(wú)水乙醇脫水各2 min， 95%、80%、70%乙醇脫水各2 min；抗原修復(fù)后加入過(guò)氧化氫(H2O2)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶；加入兔抗人Keap1多克隆抗體(1∶100稀釋)室溫靜置1 h；DAB顯色液顯色5～10 min，蘇木精復(fù)染2 min，常規(guī)脫水、透明、封片和鏡檢。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以出現(xiàn)淡黃色或棕黃色反應(yīng)判斷為陽(yáng)性。染色結(jié)果的判定采用雙盲法，由2位病理科醫(yī)師分別進(jìn)行閱片。Keap1抗原陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×200)，每個(gè)視野分別記數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)。陽(yáng)性結(jié)果的判定參照Li等[6]的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，按染色強(qiáng)度分為：0分，無(wú)染色；1分，染色呈淡黃色；2分，染色呈棕黃色；3分，染色呈棕褐色；陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%記為0分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>76%記為4分，按照染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積判定免疫組織化學(xué)表達(dá)水平。接Keap1蛋白的表達(dá)水平分為：Keap1高表達(dá)組(5～12分)和Keap1低表達(dá)組(0～4分)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。單因素分析采用χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析，表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度之間的關(guān)系采用趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC患者癌組織和癌旁組織中Keap1的表達(dá)水平 196例ESCC患者癌組織中140例表達(dá)Keap1蛋白(陽(yáng)性率71.4%)，31例癌旁組織中5例表達(dá)Keap1蛋白(陽(yáng)性率16.1%)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.474，P<0.01)。

2.2 Keap1的表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 單因素分析顯示，年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和浸潤(rùn)深度在Keap1高表達(dá)組與Keap1低表達(dá)組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。多因素分析顯示，Keap1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度有關(guān)，與年齡、腫瘤大小和分化程度無(wú)關(guān)(表2)。

2.3 Keap1的表達(dá)水平對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響 Logistic回歸分析顯示，調(diào)整年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、浸潤(rùn)深度和腫瘤部位后，Keap1表達(dá)是ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(表3)。趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)顯示，ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)隨Keap1的表達(dá)水平的升高而升高(χ2=5.173，P=0.023)。

2.4 Keap1的表達(dá)水平對(duì)浸潤(rùn)深度的影響 Logistic回歸分析顯示，調(diào)整年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤部位后，Keap1表達(dá)是ESCC侵及漿膜的危險(xiǎn)因素(表4)。趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)顯示，ESCC侵及漿膜的風(fēng)險(xiǎn)隨Keap1的表達(dá)水平的升高而升高(χ2=9.788，P=0.002)。

表1 Keap1表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理參數(shù)的單因素分析結(jié)果

參數(shù)Keap1高表達(dá)(n=87)Keap1低表達(dá)(n=109)t/χ2P性別 男48560．2800．597 女3953年齡(歲)61．8±8．753．2±7．67．324<0．01腫瘤大小(cm)6．25±2．144．18±1．867．138<0．01TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期37540．9570．328 Ⅲ、Ⅳ期5055分化程度 高、中分化76805．8060．016 低分化1129浸潤(rùn)深度 未侵及漿膜175823．220<0．01 侵及漿膜7051淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú)186518．694<0．01 有5954腫瘤部位 食管上段1923 食管中段38470．0390．981 食管下段3039

3 討論

Keap1可通過(guò)與Nrf2的結(jié)合來(lái)抑制Nrf2的活性[7]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)的Keap1處于“關(guān)閉”狀態(tài)，可使Nrf2泛素化而被降解，從而減少胞質(zhì)中的Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)移[8]。致瘤因素的刺激和氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的攻擊可使Keap1的部分結(jié)構(gòu)被修改，導(dǎo)致Nrf2結(jié)合部位的構(gòu)象改變，從而引起Nrf2與其解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與解毒Ⅱ相酶啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE) 結(jié)合[9]。Nrf2與ARE結(jié)合后可以調(diào)控下游產(chǎn)物的表達(dá)，包括血紅素加氧酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GSTs)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等具有抗炎、抗氧化作用的蛋白質(zhì)和酶，從而保護(hù)機(jī)體免受致病因素的損傷。機(jī)體恢復(fù)平衡后，Keap1又會(huì)回到“關(guān)閉”狀態(tài)，使細(xì)胞核內(nèi)/外的Nrf2恢復(fù)到原來(lái)的水平，維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)。由此可見(jiàn)，Keap1是Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路激活的“分子開(kāi)關(guān)”，但Keap1易發(fā)生突變，失去對(duì)Nrf2 的負(fù)性調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致Nrf2的核定位、表達(dá)上調(diào)及下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，同時(shí)Nrf2 在細(xì)胞核中的累積是腫瘤獲得耐藥性的重要原因之一。因此，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路具有雙重性。

白美玲等[5]的研究顯示，Keap1在ESCC組織中的陽(yáng)性率明顯高于正常的食管組織；楊海虹等[7]的研究顯示，晚期非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中Keap1 mRNA的表達(dá)明顯升高。本研究結(jié)果表明，ESCC組織中Keap1的表達(dá)率明顯高于癌旁食管組織，與白美玲等[5]的研究結(jié)果類(lèi)似，說(shuō)明Keap1的表達(dá)與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。推測(cè)其機(jī)制可能與高表達(dá)的Keap1抑制Nrf2的活化有關(guān)。通過(guò)進(jìn)一步分析癌組織中Keap1的表達(dá)水平，本研究還發(fā)現(xiàn)Keap1的表達(dá)是ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵及漿膜的危險(xiǎn)因素，且ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵及漿膜與Keap1的表達(dá)水平之間存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步證實(shí)Keap1的表達(dá)與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，Keap1的表達(dá)可促進(jìn)ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。

本研究的不足之處主要在于沒(méi)有檢測(cè)癌組織中Nrf2的表達(dá)，因此無(wú)法明確解釋Keap1促進(jìn)ESCC的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，此外，本研究人群主要來(lái)源于新疆及周邊地區(qū)，但并未對(duì)不同民族進(jìn)行分類(lèi)檢測(cè)。在下一步的工作中，我們將對(duì)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路與ESCC發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系進(jìn)行深入的研究，并納入民族、地域分布等因素，明確該信號(hào)通路在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

表2 ESCC患者癌組織中Keap1表達(dá)水平的多因素分析結(jié)果

表3 Keap1的表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析

表4 Keap1的表達(dá)與ESCC侵及漿膜的危險(xiǎn)因素分析

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.16

馬蘭英，1983年生，女， 主治醫(yī)師，碩士，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究。

唐勇，主任醫(yī)師，E-mail：mly801021@126.com。

R735.1

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2017-04-17)