許超，彭陽，史偉峰

(蘇州大學附屬第三醫(yī)院檢驗科，江蘇常州 213003)

·研究生園地·

腸道病毒71型激活人橫紋肌肉瘤細胞中JNK1/2信號轉(zhuǎn)導通路*

許超，彭陽，史偉峰

(蘇州大學附屬第三醫(yī)院檢驗科，江蘇常州 213003)

目的 探討c-Jun N端激酶(JNK)信號轉(zhuǎn)導通路在腸道病毒71型(EV71)感染中的作用。方法 臺盼藍染色法檢測不同濃度抑制劑SP600125對人橫紋肌肉瘤細胞(RD)活性的影響；實時熒光定量PCR及western blot檢測EV71感染RD細胞后VP1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平；western blot檢測JNK1/2、c-Fos、c-Jun蛋白及其磷酸化水平，并分析JNK1/2抑制劑SP600125對EV71復(fù)制及JNK1/2信號通路的影響。結(jié)果 臺盼藍染色結(jié)果表明，與空白對照組比較，5和10 μmol/L實驗組存活率差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，而20 μmol/L抑制劑組細胞存活率明顯降低(P<0.05)；實時熒光定量PCR及western blot結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組在EV71感染RD細胞8 h后，其VP1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平均明顯下降(P均<0.01)。此外，western blot檢測結(jié)果證實EV71感染RD細胞后，其JNK1/2、c-Fos和c-Jun的蛋白質(zhì)磷酸化水平均明顯升高(P均<0.05)。而經(jīng)抑制劑SP600125處理可明顯下調(diào)其JNK1/2、c-Fos、c-Jun磷酸化水平(P均<0.05)。結(jié)論 JNK1/2信號通路可被 EV71感染有效激活，并與EV71復(fù)制有關(guān)。

JNK1/2信號通路；腸道病毒71型；人橫紋肌肉瘤細胞

腸道病毒71型(EV71)感染嚴重者可引起無菌性腦炎、腦膜腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、心肌炎和肺水腫等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，重癥患者常導致死亡[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，JNK信號通路在介導多種胞外刺激誘導的細胞炎癥、應(yīng)激、凋亡、周期和生長等多種生理和病理過程中具有重要作用。EV71感染細胞后可誘導細胞凋亡，但是在不同的宿主細胞中，其誘導細胞凋亡的機制各不相同[3]。人橫紋肌肉瘤(RD)細胞是EV71的易感細胞，主要用于EV71病毒的擴增。目前，JNK信號通路激活與EV71感染性疾病的發(fā)生關(guān)系密切，但其機制仍不清楚。本研究通過用JNK特異性抑制劑SP600125阻斷細胞信號通路，觀察JNK信號通路中蛋白質(zhì)分子的活性變化及VP1蛋白(病毒復(fù)制指標)在RD細胞中的表達水平，進一步探討RD細胞中JNK信號通路活化在EV71復(fù)制中的作用，以期為相關(guān)的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 細胞存活率檢測試劑盒(臺盼藍染色法，Beyotime公司)，磷酸化蛋白質(zhì)提取試劑盒(凱基生物公司)，SP600125(JNK inhibitor,德國Selleck公司)，兔抗人JNK1/2、c-Fos、c-Jun及其磷酸化多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(美國SAB公司)，鼠抗人EV71/VP1抗體及HRP標記的羊抗鼠IgG(英國Abcam公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；7500型實時熒光定量PCR(美國ABI公司)，SMA1000超微量紫外分光光度計(北京普萊恒通公司)，CLINX化學發(fā)光成像儀(上海勤翔公司)。

1.2 病毒和細胞來源 EV71病毒株GDV083(BrCr)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；人橫紋肌肉瘤(RD)細胞由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.3 抑制劑制備 SP600125溶解于二甲基亞砜(DMSO)，終濃度為10 μmol/L，置于-20 ℃保存。

1.4 臺盼藍染色法測定細胞存活率 取生長狀態(tài)良好的RD細胞，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細胞融合度達90%時，棄去培養(yǎng)基。實驗設(shè)空白對照組(僅加PBS 2 μL)、DMSO組(僅加入DMSO 2 μL)和實驗組(加入終濃度分別為5、10、20 μmol/L SP600125)，室溫溫育1 h后，更換為新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并1 000 r/min離心5 min，收集細胞，按細胞存活率檢測試劑盒說明書操作，并用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)。細胞存活率=(細胞總數(shù)-藍色細胞數(shù))/細胞總數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5 EV71病毒感染RD細胞 取生長狀態(tài)良好的RD細胞，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細胞融合度達90%時，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞，接種至6孔細胞培養(yǎng)板(每孔4×105個)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗分為對照組(2 μL DMSO+MOI=5的EV71)和實驗組(終濃度為10 μmol/L SP600125+ MOI=5的EV71)，室溫溫育1 h后，加入相應(yīng)的病毒感染RD細胞，室溫溫育1 h后，更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并1 000 r/min離心5 min收集培養(yǎng)0、4、8、12、24 h的細胞，用于后續(xù)實驗。

1.6 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取1.5中的各組細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，SMA1000超微量紫外分光光度計檢測提取RNA濃度和純度，取濃度為300～500 ng/μL，吸光度(A260/280 nm)值為1.80～2.0的樣本用于后續(xù)實驗。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。樣本置-20 ℃保存。

1.7 引物設(shè)計及實時熒光定量PCR 根據(jù)GenBank中VP1及GAPDH基因序列(序列號分別為EUO24958和NM_002046)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由蘇州金唯智公司合成。VP1上游引物序列：5′-GAGTGGCAGATGTGATTGA-3′，下游引物序列：5′-TCCAGTGTCTAAGCGATGA-3′ ，產(chǎn)物大小為215 bp；GAPDH上游引物序列：5′-TATGACAA

CAGCCTCAAGA-3′，下游引物序列：5′- ATGAGTCCT

TCCACGATAC-3′ ，產(chǎn)物大小為101 bp。PCR總體系為20 μL，包括SYBR Green Master mix 10 μL，ROX校正染料Ⅱ 0.4 μL,10 μmol/L上、下引物各0.4 μL, cDNA 2 μL,RNA Free ddH2O補足體積。PCR循環(huán)參數(shù): 95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,共40個循環(huán)。在60 ℃時用7500 v2.0.6軟件收集熒光信號。采用2-△△Ct法計算相VP1 mRNA的對表達水平，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因)對照組。每個樣本做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.8 western blot 取上述各組細胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并1 000 r/min離心5 min，加入蛋白質(zhì)裂解液 (1 mL裂解液含蛋白酶抑制劑1 μL、磷酸酶抑制劑10 μL和PMSF 10 μL)，冰上裂解40 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清，采用BCA法測定總蛋白質(zhì)濃度。以每孔35 μg的蛋白質(zhì)量加樣至10% SDS-PAGE凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓，分離膠采用100 V電壓)。電泳結(jié)束后在300 mA恒流條件下2 h將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；經(jīng)50 g/L脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別加入兔抗人抗JNK1/2、c-Fos、c-Jun、p-JNK1/2、p-c-Fos、p-c-Jun抗體、鼠抗人EV71/VP1抗體(均為1∶1 000稀釋)及兔抗人抗GAPDH多克隆抗體(1∶5 000稀釋)4 ℃過夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫溫育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL發(fā)光液顯色，在CLINX化學發(fā)光成像儀中顯影，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)及Image J軟件對條帶進行灰度掃描進及結(jié)果判讀。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SP600125對RD細胞存活率的影響 空白對照組、DMSO組、實驗組(5、10、20 μmol/L)細胞存活率(%)分別為0.914±0.021，0.889±0.019，0.848±0.039，0.839±0.043，0.541±0.024，各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=72.37,P<0.05)。組間兩兩比較結(jié)果表明，與空白對照組相比，DMSO組、5、10 μmol/L實驗組差異均無統(tǒng)計學意義(t分別為1.53，2.58，2.72，P均>0.05)，而20 μmol/L組差異有統(tǒng)計學意義(t=20.26,P<0.05)；與20 μmol/L組相比，5、10 μmol/L實驗組差異有統(tǒng)計學意義(t分別為11.61，10.48，P均<0.05)。

2.2 SP600125對RD細胞中EV71的復(fù)制影響

2.2.1 實時熒光定量PCR檢測VP1 mRNA表達水平 與對照組(1.43±0.18，13.14±0.23，14.53±0.11)相比，實驗組在感染8、12和24 h后VP1 mRNA的表達水平降低(分別為0.55±0.12，3.51±0.15，4.97±0.13)，差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為7.05、60.74、97.23,P均<0.01)；實驗組和對照組在感染0和4 h時的VP1 mRNA都不表達，差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2.2 western blot檢測VP1蛋白表達水平 與對照組(0.65±0.02，0.79±0.04，1.10±0.04)相比，實驗組在EV71感染RD細胞8、12和24 h后VP1蛋白的灰度比值分別為0.14±0.05，0.25±0.06，0.53±0.03，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為16.4，12.97，19.75，P均<0.01 )；實驗組和對照組在感染0和4 h時的VP1蛋白都不表達。見圖1。

圖1 SP600125對EV71感染RD細胞VP1蛋白表達的影響

2.3 EV71感染對激活JNK1/2信號通路的影響 western blot結(jié)果表明，對照組在感染EV71病毒0、4、8、12和24 h的p-JNK1/2蛋白灰度比值分別為0.26±0.03，0.57±0.04，0.35±0.06，0.21±0.02，0.18±0.03，而實驗組中分別為0.12±0.02,0.14±0.03,0.09±0.01,0.10±0.02,0.08±0.01，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t分別為6.73，14.90，7.40，6.74，5.48,P均<0.01)；對照組4、8、12和24 h的JNK1/2蛋白灰度比值分別為0.42±0.04，0.73±0，03，1.01±0.05，0.85±0.02, 而實驗組分別為0.20±0.02，0.31±0.05，0.35±0.01，0.24±0.03，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t分別為8.52，12.48，22.42，29.30，P均<0.01)；而對照組和實驗組在0 h時JNK1/2蛋白灰度比值(分別為0.10±0.02，0.11±0.01)，組間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.77，P>0.05)。見圖2。

圖2 SP600125對對照組(A)和實驗組(B)JNK蛋白及其磷酸化蛋白表達的影響

2.4 SP600125對JNK1/2通路下游轉(zhuǎn)錄因子的影響 western blot結(jié)果表明，與對照組感染EV71病毒4、8、12和24 h相比，實驗組c-Fos和c-Jun的蛋白質(zhì)磷酸化水平差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖3和表1。

注：A、B,對照組、實驗組c-Fos蛋白及其磷酸化的表達水平； C、D,對照組、實驗組c-Jun蛋白及其磷酸化的表達水平。

圖3 SP600125對c-Fos、c-Jun蛋白及其磷酸化的影響

3 討論

JNK蛋白家族是絲裂原活化蛋白激酶超家族的成員之一，也被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶。JNK可介導多種胞外刺激誘導的細胞抗病毒作用，如應(yīng)激、Fas、TNF-α等。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，EV71感染RD細胞后，JNK1/2、c-Jun、c-FosmRNA表達水平上調(diào)， IL-2、 IL-4、IL-10和TNF-α細胞因子分泌明顯增加，表明這些細胞因子的分泌可能促進JNK信號通路的活化。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， EV71感染RD細胞8 h后，其VP1蛋白的表達水平明顯升高。另有研究發(fā)現(xiàn)[5]，EV71感染Hela細胞6 h即可出現(xiàn)VP1蛋白少量表達。研究表明[6]，VP1蛋白的表達水平主要是由病毒的毒力與細胞的抗病毒功能所決定。而JNK信號通路的激活能抑制細胞的抗病毒作用，促進病毒的大量復(fù)制；本研究結(jié)果表明，用抑制劑SP600125處理EV71感染RD細胞后，可明顯下調(diào)JNK1/2、c-Fos和c-Jun的蛋白磷酸化，同時EV71/VP1 mRNA及其蛋白質(zhì)的表達水平明顯下降。表明抑制JNK信號通路可抑制感染RD細胞中EV71的增殖和復(fù)制。Zhou等[7]在研究Hsa-let-7c-5p對EV71病毒復(fù)制的影響時發(fā)現(xiàn)，EV71激活JNK信號通路后，其JNK蛋白磷酸化水平明顯增強，而在加入抑制劑SP600125后，EV71病毒滴度及VP1 mRNA的表達水平明顯降低(P<0.01)，與本研究的結(jié)果較為一致。Tung等[8]研究發(fā)現(xiàn)，EV71感染SK-N-SH細胞后可激活JNK信號通路，下游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和c-Jun的蛋白磷酸化水平明顯升高，促進環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達，從而釋放大量的前列素E2(PEG2)，更有利于病毒的大量繁殖；當加入抑制劑SP600125后，EV71病毒復(fù)制明顯受到抑制，表明抑制 JNK信號通路，下游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和c-Jun的蛋白磷酸化也相應(yīng)受到抑制，環(huán)COX-2的表達降低， PEG2釋放減少，不利于病毒的大量繁殖，與本研究結(jié)果較為類似。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EV71可激活JNK信號通路有利于病毒增殖，SP600125抑制劑可通過抑制JNK信號通路影響EV71的復(fù)制，為臨床治療手足口病提供新的實驗依據(jù)。但SP600125抑制劑對細胞具有一定的毒性作用，且特異性較低，今后我們將針對JNK設(shè)計siRNA進行特異性敲減，研究其對EV71復(fù)制的影響；此外，本研究僅在細胞分子水平進行分析，下一步我們將研究EV71感染小鼠后JNK信號通路相關(guān)基因變化，同時分析在JNK敲除小鼠中EV71感染情況，并檢測病毒RNA和蛋白質(zhì)水平變化，為JNK信號通路影響EV71的復(fù)制提供更多的實驗依據(jù)。

[1]Yang L, Liu Y, Li S,etal.A novel inactivated enterovirus 71 vaccine can elicit cross-protective immunity against coxsackievirus A16 in mice[J]. Vaccine, 2016,34(48):5938-5945.

[2]Liu J, Wang B, Huang P,etal.Microcystin-LR promotes cell proliferation in the mice liver by activating Akt and p38/ERK/JNK cascades[J]. Chemosphere, 2016,163(2):14-21.

[3]Zhang H, Li F, Pan Z,etal.Activation of PI3K/Akt pathway limits JNK-mediated apoptosis during EV71 infection[J]. Virus Res, 2014,19(2):74-84.

[4]Shi W, Hou X, Li X,etal.Differential gene expressions of the MAPK signaling pathway in enterovirus 71-infected rhabdomyosarcoma cells[J]. Braz J Infect Dis, 2013,17(4):410-417.

[5]Peng X, Fang X, Li J,etal.Enhancing immune responses of EV71 VP1 DNA vaccine by co-inoculating plasmid IL-12 or GM-CSF expressing vector in mice[J]. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2016,62(4):35-41.

[6]Wu HM, Zhou K, Wu T,etal. Synthesis of pyrazine-1,3-thiazine hybrid analogues as antiviral agent against HIV-1, influenza A (H1N1), enterovirus 71 (EV71), and coxsackievirus B3 (CVB3)[J]. Chem Biol Drug Des, 2016,88(3):411-421.

[7]Zhou B, Chu M, Xu S,etal.Hsa-let-7c-5p augments enterovirus 71 replication through viral subversion of cell signaling in rhabdomyosarcoma cells[J]. Cell Biosci, 2017,7(7):14-28.

[8]Tung WH, Lee IT, Hsieh HL,etal.EV71 induces COX-2 expression via c-Src/PDGFR/PI3K/Akt/p42/p44 MAPK/AP-1 and NF-kappaB in rat brain astrocytes[J]. J Cell Physiol, 2010,224(2):376-386.

(本文編輯：許曉蒙)

Enterovirus 71 activates the JNK1/2 signaling pathway in human rhabdosarcoma cells

XUChao,PENGYang,SHIWei-feng

(DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Changzhou213003,Jiangsu,China)

Objective To investigate the role of c-Jun N-terminal kinase (JNK1/2) signaling pathway in enterovirus 71 (EV71) infection. Methods The effects of different concentrations of SP600125 on the activity of human rhabdosarcoma (RD) cells were detected by trypanbalu staining. The levels of VP1 mRNA and protein in EV71-infected RD cells were detected by real time Q-PCR and western blot, respectively. The levels of total and phosphorylated JNK1/2, c-Fos and c-Jun protein were determined by western blot. Last, the effects of JNK1/2 inhibitor SP600125 on EV71 replication and JNK1/2 signaling pathway were analyzed. Results The results of trypanbalu staining showed that 5 and 10 μmol/L of SP600125 didn′t influence on the activity of RD cells (P>0.05), while 20 μmol/L of SP600125 decreased the survival of RD cells significantly (P<0.05). Compared with the control, the expression levels ofVP1 mRNA and protein in EV71-infected RD cells decreased obviously at 8 hours post-infection (P<0.01). In addition, after RD cells were infected EV71, the levels of phosphorylated JNK1/2, c-Fos and c-Jun increased significantly (P<0.05). However, the pretreatment of SP600125 decreased the phosphorylation levels of JNK1/2, c-Fos and c-Jun protein obviously (P<0.05). Conclusion EV71 infection may effectively activate the JNK1/2 signaling pathway in RD cells, which may be related to EV71 replication.

JNK1/2 signaling pathway; enterovirus 71; human rhabdosarcoma cell

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.20

國家自然科學基金(81572052)；江蘇省自然科學基金(BK20151178)。

許超，1990年生，男，碩士研究生，主要從事臨床微生物與免疫研究。

史偉峰，主任技師，副教授，碩士研究生導師，E-mail:swf67113@163.com。

R512.5

A

2017-04-21)