張 巖， 王聰霞

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院心血管內科， 陜西 西安 710004)

血漿MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平與肺動脈高壓預后的相關性研究

張 巖， 王聰霞*

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院心血管內科， 陜西 西安 710004)

目的：探討患者血漿MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平與與肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)嚴重程度、預后的相關性。方法：采用微陣列法篩選112例PAH患者和100例健康對照者的血漿總RNA，采用實時定量聚合酶鏈反應測定miRNA-17-5p和miRNA-20a含量，測量PAH患者血漿中miRNA-17-5p、miRNA-20a的濃度。結果：在血漿miRNA濃度測定中，總共有58例miRNA血漿濃度在病例組和對照組中差異具有顯著性。在PAH組中，miRNA-17-5p和miRNA-20a上調最為明顯。ROC曲線分析顯示血漿miRNA-17-5p、miRNA-20a的濃度與PAH患者兩年生存率相關。Cox回歸分析證實miRNA-17-5p和miRNA-20a水平是PAH生存率的重要預測因素。年齡、心臟指數、WHO分級、6min步行距離、疾病持續(xù)時間、紅細胞分布寬度也可作為生存率的預測因子，加入這些協變量的多變量模型驗證miRNA-17-5p和miRNA-20a水平是PAH兩年生存率的獨立預測因子。結論：血漿中miRNA-17-5p和miRNA-20a水平的增加與PAH患者的不良預后有關。

miRNA-17-5p； miRNA-20a； 肺動脈高壓

我國的PAH的發(fā)病率和死亡率近年來迅速增加，已成為威脅我國公民健康的主要疾病。肺動脈高壓是一種肺動脈內皮細胞(PAECs)和肺動脈平滑肌細胞(PASMC)過度增殖導致的可致命的疾病。增生導致肺血管結構的變化，表現為PAECs和PASMCs的功能障礙，這是PAH的發(fā)病機制。增生進一步造成肺血管阻力增加，導致右心室心力衰竭[1]。miRNA是非蛋白編碼RNA分子，參與多種必需基因的表達和細胞進化的過程，可調節(jié)轉錄或轉錄后表達。向下調節(jié)基因表達的miRNA結合3’末端非翻譯區(qū)域的miRNA，有效的結合Watson-Crick配對算法，可以預測miRNA的靶基因[2]。miRNA可能在肺血管疾病通路中參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在肺血管生長發(fā)育、疾病形成中起重要作用，肺血管穩(wěn)態(tài)的破壞和此類miRNA下調參與PAH的發(fā)病機制[3]。骨形態(tài)蛋白Ⅱ型受體(BMPR2)、缺氧、STAT3和Apelin-APJ肺血管細胞信號通路與PAH的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。目前的研究表明，miRNA-17-5p和miRNA-20a與擴張型心肌病、先天性心臟病和中風相關。本研究的目的是探究血漿miRNA-17-5p和miRNA-20a與PAH嚴重程度、預后的相關性，進一步闡明miRNA是否可作為PAH病情程度及預后的獨立預測因子及潛在生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2010年1月至2013年12月患者進行PAH病例對照研究。病例組納入112例PAH的患者，均符合PAH的診斷標準。PAH的診斷標準是根據最新指南制定出的[5]。同時選取100例健康者作為對照組。兩組在性別、年齡上差異無顯著性。與研究對象簽署知情同意書，經過嚴格培訓的調查員調查研究對象，采用統(tǒng)一的調查問卷，并隨機進行質量控制。

1.2 方法:每個研究對象均空腹采集5mL外周血，1mL被送到實驗室立即測定血液生化指標檢測，包括血糖、總膽固醇、甘油三酯，用全自動生化分析儀(德國的歐羅巴XL-200)。其余4mL肝素抗凝并存儲在-80℃的冰箱。在這項研究中，通過電話隨訪患者，總共106個PAH患者隨訪24個月?；颊叩纳鏍顟B(tài)在2015年12月20日被調查，死亡是主要終點。6名患者失訪，主要是因為錯誤的電話號碼、拒絕繼續(xù)參與、搬出原來的地址或地址不清。失訪患者基本人口學資料(年齡、性別、吸煙、飲酒)與研究組差異無統(tǒng)計學意義。倫理審查委員會批準了本項研究，并按照《赫爾辛基宣言》進行了研究。所有受試者均獲得書面知情同意書。

1.3 microRNA檢測:采用Tiangen試劑盒提取。先提取全血基因組DNA，從血漿、循環(huán)血細胞和肺組織中分離出總RNA。利用高通量實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，7900HT(96孔、384孔和Taqman低密度表達譜芯片兼容)，進行PCR反應和端板進行閱讀和分析。miRNA的檢測采用“geniom MEPA”芯片(FEBIT生物醫(yī)學有限公司，海德堡，德國)。到目前為止，非管家基因的miRNA已被規(guī)范化驗證。在樣本中添加5nmoL/L秀麗隱桿線蟲mir-39(cel-mir-39)，cel-mir-39是一個公認的對RNA制劑進行規(guī)范化測量的標志物。為最大限度檢測miRNA的信息，采用微陣列檢測受試者血漿樣本的總RNA，通過實時定量PCR(qPCR)分別測量miRNA的含量。采用四分位數法、背景減法和消除極端離群值，進行數量統(tǒng)計。熒光定量PCR的方法檢測與應用生物系統(tǒng)進行(卡爾斯巴德、CA)，microRNA檢測應用Applied Biosystems儀檢測(圖1)。

圖1 miRNA-17-5p和miRNA-20a測定曲線

1.4 統(tǒng)計分析:χ2檢驗和t檢驗進行兩組間一般資料的分析。通過篩選分析，miRNA在病例組與對照組之間的最高倍的差異被認為是有研究價值的miRNA。采用多元Logistic回歸分析計算其95% CI，OR值表示相對風險。隨訪時間為主要心血管事件發(fā)生日期、最后隨訪日期與診斷日期的差異。丟失的例數排除在審查數據外。ROC曲線評估全因死亡率下降和生物標志物兩者之間的關系，以及生物標志物與預后之間的關系。Kaplan Meier進行生存分析，miRNA與患者死亡的發(fā)生率也進行相關分析。多變量Cox回歸分析模型被用來計算風險比(HR)和95%可信區(qū)間。所有統(tǒng)計檢驗均為雙概率檢驗，P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。所有數據均采用SPSS19.0軟件包進行。

2 結 果

2.1 一般資料比較:從表1可以看出，病例組和對照組的年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例組與對照組收縮壓、舒張壓、體重指數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例組吸煙率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。兩組飲酒量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，病例組高血壓史、糖尿病史及冠心病家族史均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。病例組高血壓史明顯高于對照組，但兩組間收縮壓和舒張壓差異不顯著，可能是由于長期服用抗高血壓藥物的關系。miRNA-17-5p和miRNA-20a在血漿分布中差異無顯著性，血流動力學參數、治療方法、N末端腦鈉肽(NT-proBNP)、紅細胞分布寬度(RDW)同為研究內容(表2)。miRNA-17-5p和miRNA-20a水平與6MWD、年齡和病程(表2，3)相關性較差。

2.2 miRNA-17-5p和miRNA-20a水平與PAH預后的相關性分析：從ROC曲線上看，miRNA-17-5p和miRNA-20a 水平與PAH患者2年生存率相關，與6mwd的距離也相關，是PAH生存率的獨立預測因子(圖2A)?；颊適iRNA-17-5p和miRNA-20a水平升高，6min步行距離縮短，且與生存時間縮短密切相關(圖2C，D)。ROC分析也評估了最佳截斷值，microrna-17-5p含量大于0.000689是預測2年生存率的重要指標(特異度76.5%，敏感度76.8%)，且在PAH的組中死亡率也較高(圖2A)。miRNA-20a含量大于0.000732可用來預測PAH患者的2年生存率，特異度91.3%，靈敏度58.8%，可作為一個高危亞組(圖2A)。

圖2 miRNA-17-5p和miRNA-20a 水平與PAH預后的相關性分析

Cox回歸生存分析確定miRNA-17-5p和miRNA-20a可PAH患者生存率的獨立預測因子。年齡、EF值、WHO功能分級、6MWD、病程時間和RDW也可預測生存率(表4)。RDW及6MWD可獨立預測PAH的生存率，增加了microrna-17-5p和miRNA-20a水平的多因素模型中，miRNA-17-5p 和miRNA-20a水平是PAH生存率的獨立預測因素(危險比0.589，P = 0.012；危險比0.478，P<0.01)。在雙變量模型中，研究的隊列數據顯示miRNA-17-5p和miRNA-20a是校正了年齡、EF值、疾病時間、NT-proBNP后的獨立預測因子(表4)。

表1 一般資料比較

表2 miR17-5p水平在病例組中的分布情況

表3 miR20a水平在病例組中的分布情況

表4 Cox回歸生存分析

3 討 論

miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA的單鏈分子，長度約21至24個核苷酸。它與靶mRNA互補配對可以識別靶mRNA，通過降解mRNA或抑制其蛋白質的翻譯而實現對靶基因的表達調控。因此，miRNA參與細胞的生長、發(fā)育、分化和增殖等生命過程。miRNA能夠針對多個蛋白編碼基因，參與多個細胞生長發(fā)育階段的調控，在維護肺血管的平衡穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。miRNA表達的異常可能是各種疾病包括PAH的發(fā)病機制。

研究表明，miRNA-204在PAH患者的肺組織和PASMCs含量降低，并且在動物模型上發(fā)現miRNA-204與細胞增殖相關。miR-17/92簇也在PAH中表達，可通過IL-6信號通路下調(BMPR)-2下游區(qū)域[6]。miR-21可以通過BMP-Smad信號通路誘導，已報道其在PAH患者的血液細胞和肺組織樣本下調[7]。miRNA與肺動脈高壓的相關分析發(fā)現miRNA的變化及調節(jié)可能參與PAH的病理生理過程[8]。BMPR2信號通路在維持肺血管穩(wěn)態(tài)[9]中起著至關重要的作用，這一信號通路受到干擾和BMPR2基因突變可能形成PAH[10]。雖然BMPR2功能障礙被認為是肺動脈高壓的發(fā)病特征，很少有研究評估PAH與BMPR2功能障礙的相關機制。miRNAs是否參與BMPR2與PAH的發(fā)病過程尚未有相關研究。

有研究表明，miRNA-BMPR2信號通路的研究中，IL-6介導STAT3的激活誘導細胞miR-17-92基因簇的表達[11]。通過相應的miRNA基因簇編碼miR-17-5p和miR-20a，可以針對性的下調BMPR2蛋白的表達[12]。因此，曾有兩組研究評價這兩個miRNA(miR-17和miR-20a)抑制劑治療PAH的潛力。在嚙齒類動物模型上，靜脈注射miR-17抑制劑已被證明是改善實驗性肺動脈高壓(PAH)的手段。此外，用miR-17抑制劑[13]治療后，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(P21)，一個已知的miR-17目標基因，在小鼠和大鼠的肺組織中含量增加，在人肺動脈平滑肌細胞中也呈增加趨勢[14]。同時也有研究表明，miR-20a抑制劑治療對缺氧誘導的PAH模型小鼠右心室肥厚和肺動脈血管重構有改善作用，通過肺組織及肺動脈平滑肌細胞BMPR2的下游信號通路的誘導BMPR2的表達[15]。

本研究通過測定PAH的血漿miRNA的差異，提示miRNA-17-5p和miRNA-20a水平與PAH嚴重程度呈正相關。miRNA-17-5p和miRNA-20a水平升高，6min步行距離縮短，且與生存時間縮短密切相關。miRNA-17-5p含量大于0.000689是預測2年生存率的重要指標，且在PAH的組中死亡率也較高。miRNA-20a含量大于0.000732可用來預測PAH患者的2年生存率，可作為一個高危亞組。兩者皆是6MWD、WHO功能分級和其他臨床指標以外的獨立預測因子。

本研究得出以下結論，miRNA-17-5p、miRNA-20a血漿水平PAH的生存率相關。miRNA-17-5p、miRNA-20a的重要性仍需進一步研究，其他miRNA與肺動脈高壓的關系也需做進一步的相關研究。miRNA和PAH形成調節(jié)關系的研究為研究者揭示全新的視野，本研究為miRNA對肺動脈內皮細胞和平滑肌細胞離子通道影響提供依據，為PAH患者預后的預測提供獨立的生物學指標。

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Correlation between Plasma Levels of MicroRNA-17-5p andmicroRNA-20 and Prognosis of Pulmonary Arterial Hypertension

ZHANGYan,WANGCongxia,LIYongqin,etal

(TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,ShaanxiXi'an710004,China)

Objective:To investigate the correlation between the level of plasma MicroRNA-17-5p and microRNA-20 and the severity and prognosis of pulmonary arterial hypertension (PAH). Methods: A microarray screen was performed on total plasma RNA from 112 patients with PAH and 100 healthy control subjects Quantitative polymerase chain reaction commend increased microRNA-17-5p and microRNA-20a concentrations and was then used to measure microRNA-17-5p and microRNA-20a levels in cohort of patients with PAH's circulating microvesicles and blood cells. Results: Fifty-eight miRNAs showed differences in plasma concentration. MicroRNA-17-5p and microRNA-20a are the largest up-regulation in PAH. Receiver-operator-characteristic analysis showed both raw and normalized plasma microRNA-17-5p and microRNA-20a levels correlated with 2-year survival in patients with PAH. Cox regression analysis confirmed that miRNA-17-5p and miRNA-20a levels were important predictors of PAH survival. Age, baseline cardiac index, World Health Organization functional class, 6-minute walk distance, disease duration, and red cell distribution width also predicted survival. Entering these covariates in a multivariable model veried plasma microRNA-17-5p and microRNA-20a levels as independent predictoras of survival in PAH. Conclusion: Increased circulating microRNA-17-5p and microRNA-20a levels are associated with poor survival in PAH.

miRNA-17-5p; miRNA-20a; Pulmonary arterial hypertension

1006-6233(2017)08-1236-06

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.08.002

*【通訊作者】王聰霞， 李永勤， 張春艷， 胡艷超， 李滿祥