谷敬鋒, 王桂琦, 劉海霞, 高英超, 王園園

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院, 河北 石家莊 0500312.河北省石家莊市第一醫(yī)院， 河北 石家莊 050011)

結(jié)直腸癌MICA基因的表達(dá)與p53 K-ras基因突變的關(guān)系研究*

谷敬鋒1, 王桂琦1, 劉海霞2, 高英超1, 王園園

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院, 河北 石家莊 0500312.河北省石家莊市第一醫(yī)院， 河北 石家莊 050011)

目的：分析結(jié)直腸癌MICA基因的表達(dá)與p53、K-ras基因突變的關(guān)系。方法:回顧性分析我院2014年3月至2016年3月收治的66例結(jié)直腸癌患者的臨床資料，應(yīng)用半定量PCR-SSCP技術(shù)，對癌組織mdr1基因表達(dá)量與p53、K-ras進(jìn)行檢測，并分析結(jié)直腸癌MICA基因表達(dá)與p53、K-ras基因突變間的相互關(guān)系。結(jié)果:經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MICA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者腫瘤部位、年齡、性別無相關(guān)性(P>0.05)。于66例患者中，22例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的MICA平均表達(dá)量明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。8例K-ras、p53基因聯(lián)合突變者M(jìn)ICA基因平均表達(dá)量高于非聯(lián)合突變者，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，12例K-ras基因突變者M(jìn)ICA平均表達(dá)量稍高于未突變者，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，16例p53基因突變者M(jìn)ICA平均表達(dá)量顯著優(yōu)于p53基因未突變者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:MICA基因高表達(dá)已成為了結(jié)直腸癌的關(guān)鍵檢測指標(biāo)，而p53、K-ras基因與其高表達(dá)具有相關(guān)性。

MICA基因； K-ras基因； p53基因； 結(jié)直腸癌

與正常結(jié)直腸組織相比，結(jié)直腸腫瘤中，MICA表達(dá)水平相對較高[1]。目前，針對結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制研究有多種。諸多分子生物學(xué)研究提示,針對腫瘤細(xì)胞而言，其對化療應(yīng)答敏感性的靶點(diǎn)在于細(xì)胞基因型，化療制劑基因毒性對其無明顯影響[2,3]?，F(xiàn)階段，利用基因型對腫瘤化療敏感性進(jìn)行預(yù)測已逐漸引起了臨床研究者的重視。為了深入探究結(jié)直腸癌MICA基因的表達(dá)與p53、K-ras基因突變的關(guān)系，本文主要對我院2014年3月至2016年3月收治的66例結(jié)直腸癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，相關(guān)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:本組選擇我院于2014年3月至2016年3月收治的結(jié)直腸癌患者66例為研究對象，均經(jīng)活檢組織病理學(xué)檢查確診，其中男性36例，女性30例，年齡(22～54)歲，平均年齡(37.28±2.17)歲；22例DukeA期，23例DukeB期，10例DukeC期,11例DukeD期；53例行結(jié)直腸癌根治術(shù)，13例行姑息性切除術(shù)。

1.2 方法:①結(jié)直腸癌基因組DNA提?。航?jīng)液氮留存癌旁組織、癌組織與正常組織勻漿，通過蛋白酶K行消化處理，并結(jié)合酚/氯仿進(jìn)行抽提，于冷無水乙醇中予以沉淀、溶解(0.1×TE)，最后留存?zhèn)溆?；②引物設(shè)計(jì)：K-ras、p53基因引物序列依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[1]來進(jìn)行，由上海瀚為生物科技有限公司合成；③PCR反應(yīng)：該反應(yīng)總體積達(dá)50μL，于94℃環(huán)境下，PCR循環(huán)儀變形達(dá)至75s，于54℃環(huán)境下退火60s，72℃下拓寬至60s。依照上述方法反復(fù)35次，最終于75℃環(huán)境下延伸至300s；④電泳與銀染：擇取5μLPCR產(chǎn)物，加入5μL緩沖液混合，于98℃環(huán)境下變形處理600s，完畢后冰浴驟冷300s[4]。繼后，加入8%的聚丙烯酰胺，行電泳處理，持續(xù)5h，并行銀染鑒定。

1.3 觀察指標(biāo):檢測癌組織MICA基因表達(dá)量與p53、K-ras基因突變狀況。MICA基因檢測步驟：

1.3.1 標(biāo)本采集:經(jīng)液氮留存癌旁組織、癌組織與正常組織勻漿，貯存在-20℃以下待實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)本DNA提取:采用Pel-Freeze DNA商用抽提試劑盒。

1.3.3 2-6外顯子測序分析:①PCR擴(kuò)增:引物參照MICA基因序列，采用兩對引物分別對2-6外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。其中第1對引物可擴(kuò)增MICA 2-5號(hào)外顯子，另1對引物擴(kuò)增第5、6號(hào)外顯子。PCR引物序列和擴(kuò)增條件參照正文，擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL。②PCR產(chǎn)物純化:每孔中加進(jìn)核酸外切酶Ⅰ1μL(5U)，蝦堿性磷酸酶2μL(2U)，ABI公司的9700型PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀進(jìn)行酶切反應(yīng)，37℃30min，80℃15min。③測序反應(yīng):分別針對外顯子2、3、4、5、6設(shè)計(jì)測序引物，進(jìn)行雙向測序。以純化PCR產(chǎn)物為模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)試劑盒操縱進(jìn)行測序反應(yīng)，ABI公司9700型PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5min，95℃30s，50℃10s，60℃4min，30個(gè)循環(huán)，冷卻至4℃。④測序反應(yīng)純化和電泳分析:采用乙醇/醋酸鈉法純化，然后在ABI 3730測序儀上進(jìn)行測序電泳分析。⑤測序結(jié)果分析和判定:采用Assign 3.5分析軟件和MT Navigator軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，由Assign 3.5軟件指定終極結(jié)果。

1.3.4 GeneScan檢測5號(hào)外顯子GCT重復(fù)數(shù)目：①GeneSean擴(kuò)增:引物參照有關(guān)文獻(xiàn)，正向引物5'端標(biāo)記有FAM熒光團(tuán)體。引物序列和擴(kuò)增條件參照正文，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL。②GeneScan上機(jī)檢測:GeneScan擴(kuò)增產(chǎn)物1:10稀釋后，取5μL PCR產(chǎn)物4.8μL甲酰胺0.2μL內(nèi)標(biāo)充分混勻，95℃4min變性后，在ABI 3730測序儀上進(jìn)行GeneScan模式分析。③GeneScan結(jié)果分析和判定:采用GengMapper v3.7自動(dòng)判定結(jié)果，根據(jù)片斷長度大小推測GCT重復(fù)次數(shù)，并與5號(hào)外顯子測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 MICA缺失型等位基因檢測:采用PCR-SSP的方法，引物參照有關(guān)文獻(xiàn)[5]，一對引物擴(kuò)增MICA*Del等位基因的守舊序列，另外一對引物擴(kuò)增人類生長激素的同源守舊序列，擴(kuò)增反應(yīng)體系為10μL。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組間的MICA表達(dá)分析:經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MICA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者腫瘤部位、年齡、性別無相關(guān)性(P>0.05)。66例患者中，22例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的MICA平均表達(dá)量明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組間的MICA表達(dá)分析

注：*與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.2 K-ras、p53基因聯(lián)合突變者與非聯(lián)合突變者間的MICA表達(dá)分析:8例K-ras、p53基因聯(lián)合突變者M(jìn)ICA基因平均表達(dá)量高于非聯(lián)合突變者，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

2.3 K-ras基因突變組與未突變組的MICA表達(dá)分析:12例K-ras基因突變者M(jìn)ICA平均表達(dá)量稍高于未突變者，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表2 K-ras、p53基因聯(lián)合突變者與非聯(lián)合突變者間 的MICA表達(dá)分析

注：*與非聯(lián)合突變組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

注：*與未突變組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.4 p53基因突變組與未突變組的MICA表達(dá)分析:16例p53基因突變者M(jìn)ICA平均表達(dá)量顯著優(yōu)于p53基因未突變者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，免疫組化顯示正常結(jié)直腸導(dǎo)管上皮細(xì)胞MICA表達(dá)陰性(-)；高分化結(jié)直腸癌MICA表達(dá)弱陽性(+)；中低分化結(jié)直腸癌MICA表達(dá)陽性(++)；低分化結(jié)直腸癌MICA表達(dá)強(qiáng)陽性(+++)。詳見表4。

表4 p53基因突變組與未突變組的MICA表達(dá)分析

注：*與未發(fā)生突變組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖1 正常組織、結(jié)直腸癌MICA免疫組織染色

分別為100(上)、400(下)倍鏡下表現(xiàn)；(A1，2) 正常結(jié)直腸導(dǎo)管上皮細(xì)胞MICA表達(dá)陰性(-)；(B1，2) 高分化結(jié)直腸癌[67歲，T1N0M0，Gleason 3，MICA表達(dá)弱陽性(+)]；(C1，2) 中低分化結(jié)直腸癌[59歲，T2N0M0，Gleason 7，MICA表達(dá)陽性(++)]；(D1.2)低分化結(jié)直腸癌[72歲，T2N1M0，Gleason 9，MICA表達(dá)強(qiáng)陽性(+++)]。

3 討 論

結(jié)直腸癌形成過程中，原癌基因ras與抑癌基因p53突變屬于其常見基因改變現(xiàn)象。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞中，p53基因突變約占50%～80%,多為第7、8外顯子；而ras基因突變多為K-ras基因第12位點(diǎn)，其突變率約為50%[6]。研究發(fā)現(xiàn)，對17例Duckes D期結(jié)直腸癌患者術(shù)后予以5-Fu治療，經(jīng)p53基因檢測提示突變者預(yù)后與未接受5-Fu治療者無明顯差異；而與未行5-Fu治療者比較，p53基因未突變者接受5-Fu治療后平均生存期為其4倍左右,表明化療療效與p53基因狀態(tài)相關(guān)[7,8]。p53在MICA基因產(chǎn)物P-糖蛋白的影響下可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性藥物復(fù)合物外流，進(jìn)而抑制DNA損傷[9]。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織(p53基因突變)中,與未突變者比較,突變者M(jìn)ICA表達(dá)量存在明顯差異；與K-ras、p53基因未發(fā)生聯(lián)合突變者比較，聯(lián)合突變者M(jìn)ICA表達(dá)量明顯較高,充分證實(shí)結(jié)直腸癌MICA基因高水平表達(dá)與K-ras、p53基因突變密切相關(guān)。

通常而言，p53基因?qū)?xì)胞耐藥性的影響多經(jīng)由影響WT1基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。WT1基因?qū)儆谝职┗蛑?，對MICA基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，而誘導(dǎo)耐藥的主要蛋白屬于MICA基因產(chǎn)物P-gp蛋白。在本文研究中，MICA表達(dá)量與K-ras基因突變間的差異無明顯變化，但針對K-ras基因突變者而言，其MICA表達(dá)量處于較高狀態(tài),而兩基因聯(lián)合突變者明顯增高，故MICA基因表達(dá)與K-ras基因突變間具有一定的關(guān)聯(lián)性。究其作用途徑，于腫瘤發(fā)生過程中，p53、K-ras基因突變可激活MICA啟動(dòng)子，進(jìn)而誘導(dǎo)MICA基因高水平表達(dá)。于本文研究中，22例結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移者M(jìn)ICA基因表達(dá)量明顯上升。目前，分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，臨床諸多研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞命運(yùn)主要取決于細(xì)胞基因型，MICA基因高表達(dá)已成為了結(jié)直腸癌檢測的關(guān)鍵指標(biāo)。

綜上所述，結(jié)直腸癌MICA基因高水平表達(dá)與K-ras、p53基因密切相關(guān)，這對結(jié)直腸癌檢測，及預(yù)防天然耐藥具有一定的指導(dǎo)作用，應(yīng)引起足夠重視。

[1] 陳曦.中國人結(jié)直腸癌中APC、p53、K-ras和PIK3CA基因突變的研究[D].安徽醫(yī)科大學(xué),2012.

[2] 馬列,趙明靜,王群,李秀林,王笑歌.結(jié)直腸癌p53、FHIT、K-RAS基因突變與吸煙相關(guān)性Meta分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2011,26(10):1982～1987.

[3] 李婷婷.HOXB7激活WnT/β-Catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制[D].南方醫(yī)科大學(xué),2013.

[4] 趙莉.結(jié)直腸癌臨床特點(diǎn)及癌變相關(guān)分子機(jī)制的異同分析[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2010.

[5] Lteif A A，Han K，Mather KJ.Obesity，insulin resistance and the metabolic syndrome：determinants of endothelial dysfunction in whites and blacks[J].Circulation，2013，112(1)：32～38.

[6] Harred J F,Knight AR, McIntyre JS.Dow chemical campany, assignee expoxidation process[J].USP atent 3,2012，3(17):1927～1904.

[7] Foley RN，Parfrey PS，Sarnak MJ.Epidemiology of cardiovasc-ular disease in chronic renal disease[J].Am Soc Nephrol，2013，9 (12Suppl)：16～23.

[8] Malyszko J.Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease[J].Clin Chim Acta，2010,411(19/20)：1412～1420.

[9] Izumi S，Muano T，Mori A，et al.Common carotid artery stiffness cardiovascular function and lipid metabolism after menopause[J].Life Sci，2012，78(15)：1696～1701.

The Relationship between MICA Gene Expression ofBladder Cancer and Mutation of p53 and K-ras Gene

GUJingfeng,WANGGuiqi,etal

(TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,HebeiShijiazhuang050031,China)

Objective:To investigate the relationship between the expression of MICA gene in bladder cancer and the mutation of p53 gene and K-ras gene. Methods: 66 cases of bladder cancer patients with clinical data in our hospital from March 2014 to March 2016 were analyzed. Semi quantitative PCR-SSCP technique was used to detect the expression of MDR1 gene and p53 and K-ras in cancer tissues, and analyzed the relationship between the expression of MICA gene in colorectal cancer and the mutation of p53 and K-ras genes. Results: The study found that there was no correlation between the expression of MICA and the location, age and sex of the patients with colorectal cancer (P > 0.05). In 66 patients, the mean expression of MICA in 22 lymph node metastasis patients was higher than that without lymph node metastasis, and the difference was statistically significant (P < 0.05). 8 cases of K-ras and p53 gene expression of the MICA gene mutation combined with average weight is higher than non mutation, the difference was statistically significant (P < 0.05), 12 cases of K-ras gene mutation MICA average expression was slightly higher than that without mutation, but the difference was not statistically significant (P > 0.05), 16 cases of p53 gene mutation MICA expression was significantly better than the average mutation in the p53 gene, the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion: The high expression of MICA gene has become a key indicator for the detection of bladder cancer, and the correlation between K-ras and p53 gene and its high expression.

MICA gene; K-ras gene; p53 gene; Bladder cancer

河北省衛(wèi)計(jì)委資助項(xiàng)目，(編號(hào)20160203)

1006-6233(2017)08-1233-04

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.08.001

論 著