阮建+郭峰+李新國(guó)+史靈敏+田?，?張會(huì)+萬(wàn)書(shū)波+彭振英

摘要：抗性篩選是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中不可或缺的步驟，但是抗生素的使用對(duì)花生組培苗的生長(zhǎng)與生根有著顯著影響。為了明確抗生素對(duì)花生組培苗生根的敏感質(zhì)量濃度，本試驗(yàn)以花生栽培品種豐花1號(hào)組培苗為材料，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的頭孢霉素與卡那霉素，檢測(cè)花生組培苗的生根率及植株生長(zhǎng)狀況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：0～250 mg/L的頭孢霉素對(duì)花生組培苗生根及植株生長(zhǎng)基本無(wú)影響。卡那霉素對(duì)花生組培苗生根影響較為顯著，0～10 mg/L卡那霉素對(duì)花生組培苗生根與生長(zhǎng)基本無(wú)影響，10 mg/L卡那霉素條件下組培苗不長(zhǎng)側(cè)根，15 mg/L卡那霉素顯著抑制根的伸長(zhǎng)；切去不生根的組培苗底端后移入MS培養(yǎng)基又能重新生根，不切去底端的組培苗則不生根。經(jīng)過(guò)75 mg/L卡那霉素篩選的抗性組培苗的生根率可達(dá)31%。本研究可為花生遺傳轉(zhuǎn)化后期根的誘導(dǎo)提供一定的理論支持。

關(guān)鍵詞：頭孢霉素；卡那霉素；花生；組培苗；生根率；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.201 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）08-0033-05

Abstract Resistance screening is an indispensable step in Agrobacterium mediated genetic transformation of peanut， but the use of antibiotics have significant influence on peanut seedling growth and rooting. In order to make clear the sensitive concentration of antibiotics on rooting of peanut seedlings， the peanut cultivation variety Fenghua 1 tissue culture seedlings were used as experimental materials， and the culture media with different concentrations of kanamycin or cefotaxime were used to detect the peanut seedling rooting rate and growth status. The results showed that 0～250 mg/L cefotaxime had little effect on peanut growth，while kanamycin had significant effect on peanut seedling rooting. 0～10 mg/L kanamycin has no obvious effect on peanut seedling rooting and growth， but under the condition of 10 mg/L kanamycin， the seedlings had no branch roots， whats more， 15 mg/L kanamycin significantly inhibited the elongation of roots. When the rootless plantlets were transfered into MS medium after cutting off the bottom of the seedlings， the roots grew out again， whereas the rootless plantlets did not grow roots if not cutting off the bottom. After screening with 75 mg/L kanamycin， the rooting rate of the kanamycin-resistant tissue culture plantlets could reach 31%. This study could provide certain theoretical supports for roots induction during the late stage of peanut genetic transformation.

Keywords Cefotaxime； Kanamycin； Peanut； Tissue culture seedling； Rooting rate； Genetic transformation

花生（Arachis hypogaea L.）是世界主要油料作物之一，種植地區(qū)主要分布在亞洲、非洲和美洲。中國(guó)是花生生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó)?；ㄉ椭扛哌_(dá)50%，與其它油料作物相比，在含油量、單產(chǎn)、單位面積產(chǎn)油量等方面均具有一定優(yōu)勢(shì)[1]。

基因工程為花生遺傳改良提供了新的手段，可以通過(guò)外源基因?qū)爰斑z傳調(diào)控技術(shù)提高花生的抗逆性和改良花生的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[2-4]?；ㄉＳ玫霓D(zhuǎn)化方法主要有三類(lèi)：一是基因槍法轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織，通過(guò)體胚發(fā)生途徑分化再生；二是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化胚小葉、子葉（節(jié)）或胚軸外植體，通過(guò)體胚發(fā)生或器官發(fā)生途徑分化再生；三是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化莖尖外植體，直接發(fā)育成苗[5，6]。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法以其方法簡(jiǎn)單、效率高、拷貝數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)成為重要的、行之有效的方法之一[6]。

在花生陽(yáng)性遺傳轉(zhuǎn)化植株篩選階段，污染是經(jīng)常發(fā)生的一種現(xiàn)象。污染包括真菌污染與細(xì)菌污染。真菌污染主要是孢子生長(zhǎng)，污染后不易抑制應(yīng)及時(shí)淘汰；細(xì)菌污染菌落吸附在培養(yǎng)基表面，可以通過(guò)抗生素進(jìn)行抑制[7]。植物材料受農(nóng)桿菌浸染后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的共培養(yǎng)，需要用抗生素及時(shí)有效地殺死或抑制細(xì)菌，以防止細(xì)菌危害植物組織并影響植株再生。常用抗生素為頭孢霉素與青霉素[8，9]，后期還會(huì)利用卡那霉素等抗生素進(jìn)行陽(yáng)性苗篩選，但是向培養(yǎng)基中加入抗生素勢(shì)必影響植物組織的正常生長(zhǎng)與分化[10，11]。因此，研究抗生素對(duì)花生組培苗生根以及植株生長(zhǎng)的影響，確定抗生素的適用范圍和使用量，對(duì)優(yōu)化花生遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程、提高遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要意義[12]。該試驗(yàn)旨在研究不同濃度頭孢霉素和卡那霉素對(duì)花生組培苗生根及植株生長(zhǎng)的影響，以期為提高花生組培苗的生根率提供有力依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生栽培品種豐花1號(hào)，本實(shí)驗(yàn)室自存。頭孢霉素和卡那霉素均購(gòu)自國(guó)藥。試驗(yàn)于2016年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心組培室進(jìn)行。

1.2 花生組培苗培養(yǎng)

挑選飽滿且大小均勻一致的豐花1號(hào)種子，用75%酒精溶液消毒2 min后用無(wú)菌水清洗兩遍，再用0.1%升汞溶液消毒8 min后用無(wú)菌水反復(fù)清洗5～6遍。將種子剝皮后放入1/2 MS培養(yǎng)基，置于25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)7天左右，切下頂芽作為外植體備用。

1.3 不同濃度抗生素處理

將切下的頂芽置于下列添加不同抗生素的MS基本培養(yǎng)基上。頭孢霉素共計(jì)7個(gè)濃度梯度，分別為25、50、75、100、150、200、250 mg/L，以不添加頭孢霉素的MS培養(yǎng)基為對(duì)照。卡那霉素共計(jì)6個(gè)濃度梯度，分別為5、10、15、20、25、30 mg/L，以不添加卡那霉素的MS培養(yǎng)基為對(duì)照。每種培養(yǎng)基插入的頂芽不少于30個(gè)。將培養(yǎng)材料置于25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，每日觀察并記錄植株生長(zhǎng)與生根情況。

1.4 生根率與植株生長(zhǎng)情況調(diào)查

從植株生根（0.1 cm）開(kāi)始計(jì)算，到生根數(shù)目不再發(fā)生變化為止，計(jì)算每天的生根率，污染的植株不計(jì)算在內(nèi)。生根率（%）=生根植株數(shù)/供試植株總數(shù)×100。

觀察并分析不定根長(zhǎng)度、粗細(xì)、生長(zhǎng)狀態(tài)、顏色變化及側(cè)根萌發(fā)、植株生長(zhǎng)情況等。

1.5 花生卡那抗性轉(zhuǎn)基因組培苗的篩選與生根

花生遺傳轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性株系的篩選具體參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下：將攜帶卡那抗性基因的載體PRI101-AN通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到花生品種豐花1號(hào)的下胚軸中，誘導(dǎo)下胚軸產(chǎn)生大量叢生芽；將叢生芽轉(zhuǎn)移到含有75 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行陽(yáng)性組培苗的篩選，經(jīng)過(guò)大約1個(gè)月的篩選獲得抗性組培苗。將抗性組培苗切去莖底端，保留頂端較為幼嫩且木質(zhì)化程度較低的部分，接種到不含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定根并進(jìn)行生根率統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭孢霉素對(duì)花生組培苗生根和生長(zhǎng)的影響

在植株培養(yǎng)第4天起組培苗基部不定根開(kāi)始萌發(fā)，此時(shí)起統(tǒng)計(jì)其生根率（表1）。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的比較分析，發(fā)現(xiàn)25～250 mg/L濃度的頭孢霉素對(duì)花生植株生根基本無(wú)影響（最終發(fā)根率都在95%以上）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)不定根長(zhǎng)到1 cm左右時(shí)開(kāi)始長(zhǎng)側(cè)根，通過(guò)對(duì)各個(gè)濃度梯度的植株生長(zhǎng)情況比較發(fā)現(xiàn)，不同頭孢霉素濃度的培養(yǎng)基中組培苗生根的情況無(wú)明顯差異，后期植株的株高及測(cè)根的生長(zhǎng)情況都比較類(lèi)似。這說(shuō)明在25～250 mg/L濃度范圍內(nèi)，頭孢霉素對(duì)花生組培苗生根及植株生長(zhǎng)情況基本沒(méi)有影響。

2.2 卡那霉素對(duì)花生組培苗生根與生長(zhǎng)的影響

從植株培養(yǎng)第4天起統(tǒng)計(jì)其生根率，結(jié)果（表2）表明，不同濃度的卡那霉素顯著影響花生組培苗生根和生長(zhǎng)。5～15 mg/L濃度的卡那霉素對(duì)生根率的影響差異不顯著，但經(jīng)過(guò)后期不定根、植株生長(zhǎng)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，卡那霉素濃度為5 mg/L時(shí)不定根比較粗短，側(cè)根少；濃度為10 mg/L時(shí)不定根雖長(zhǎng)但無(wú)側(cè)根；濃度為15 mg/L時(shí)不定根均不到1 cm，以后便不再生長(zhǎng)，呈現(xiàn)褐色。隨著卡那霉素濃度的升高生根率越來(lái)越低，當(dāng)濃度為20 mg/L時(shí)，不定根長(zhǎng)只有0.1 cm；而當(dāng)濃度提高到25 mg/L時(shí)，則能夠完全抑制花生組培苗生根（表3、圖1）?？梢?jiàn)較高濃度的卡那霉素對(duì)花生組培苗生根具有顯著的抑制作用。

就組培苗生長(zhǎng)狀況來(lái)說(shuō)，5～10 mg/L卡那霉素處理與對(duì)照植株相比無(wú)明顯差異，但15～20 mg/L卡那霉素處理的組培苗與對(duì)照相比則明顯生長(zhǎng)緩慢。第15天時(shí)，對(duì)各處理植株進(jìn)行比較，25～30 mg/L卡那霉素處理下，植株一直保持原有高度（表3）。

將25～30 mg/L卡那霉素濃度處理下不生根的組培苗分成兩部分，一部分直接轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，另一部分將莖底端切去以后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果表明，切去莖底端的不生根組培苗又能重新生根且長(zhǎng)勢(shì)良好，沒(méi)有切去底端的依然不能生根（圖2）。

2.3 花生卡那抗性組培苗生根情況分析

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的卡那霉素處理對(duì)花生組培苗生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。文獻(xiàn)報(bào)道，高濃度的卡那霉素處理可使花生組培苗褪去綠色，植株變黃[14]，但是具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株卻能夠一直保持綠色和良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。這就是我們利用卡那霉素篩選抗性植株的依據(jù)。根據(jù)前期研究結(jié)果確定75 mg/L卡那霉素處理豐花1號(hào)轉(zhuǎn)基因組培苗可以獲得較為理想的篩選結(jié)果。為了驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)基因組培苗的生根情況，我們將其切去莖底端后接種到不含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定根。經(jīng)過(guò)大約2～3周時(shí)間可見(jiàn)從莖底部長(zhǎng)出不定根。據(jù)統(tǒng)計(jì)，生根率可達(dá)31%（圖3）。

3 討論與結(jié)論

花生是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。但是花生的組織培養(yǎng)與小麥、水稻、玉米等作物相比，差距很大，主要原因就是花生組培苗生根難、生根慢，而且生出的根多為畸形根，因而造成組培苗移栽成活率很低。對(duì)此人們想出很多辦法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，其中較為有效的一種就是嫁接法[15，16]，暫時(shí)緩解了花生組培苗生根難的問(wèn)題。但是嫁接苗畢竟不同于實(shí)生苗，外植體嫁接過(guò)程中砧木會(huì)對(duì)接穗的適應(yīng)性、抗病性、開(kāi)花結(jié)果能力產(chǎn)生影響[17-19]。盡管花生接穗與砧木都是同一品種，但新基因的導(dǎo)入很可能使砧木對(duì)接穗產(chǎn)生影響，這嚴(yán)重影響成活率及其后期的轉(zhuǎn)基因苗的生理特性，因此要求花生的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株系必須長(zhǎng)出自己的不定根。

抗生素（antibiotic）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，為能干擾其它生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。卡那霉素是一種蛋白質(zhì)生物合成抑制劑，通過(guò)與30S核糖體結(jié)合從而致使mRNA密碼誤讀?？敲顾乜剐缘馁|(zhì)粒經(jīng)常被作為選擇基因或標(biāo)記基因用于分子克隆中。研究表明，卡那霉素對(duì)植物組培苗生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，大多植物材料對(duì)卡那霉素的敏感濃度為 5～100 mg/L，但是不同植物、不同材料、不同培養(yǎng)階段的耐受濃度各不相同。30 mg/L 卡那霉素能夠明顯抑制菊花莖段的分化，10 mg/L 能夠抑制生根[20]。楊樹(shù)葉片對(duì)卡那霉素的敏感濃度為 20～40 mg/L[21，22]。川芎的根、莖、葉對(duì)卡那霉素的耐受濃度為 20～40 mg/L[23]。黃瓜幼苗對(duì)卡那霉素的耐受濃度較高，可達(dá)200 mg/L[24]。endprint

在花生的遺傳轉(zhuǎn)化中，常以頭孢霉素作為光譜抗菌劑抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，避免植株遭受污染，而以卡那霉素作為篩選劑進(jìn)行陽(yáng)性株系的篩選。王鳳歡等[14]研究花生胚小葉對(duì)卡那霉素的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同基因型對(duì)卡那霉素的敏感性不同，叢生芽生根的篩選濃度從10～20 mg/L不等。本研究表明，豐花1號(hào)組培苗對(duì)卡那霉素的敏感濃度為20 mg/L，高于此濃度則不生根。還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)卡那霉素處理的不生根組培苗，須將其底端切去后再轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基中才能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根，而沒(méi)有切去底端的組培苗則很難生根，這有可能是因?yàn)榻M培苗莖底端積累了較多卡那霉素，抑制了花生組培苗生根。

在花生的遺產(chǎn)轉(zhuǎn)化中，卡那霉素的抗性篩選這個(gè)步驟至關(guān)重要?？敲顾貪舛忍停瑒t不能充分抑制或殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性率過(guò)高；卡那霉素濃度過(guò)高，又抑制甚至殺死轉(zhuǎn)化細(xì)胞，導(dǎo)致不能得到足量的轉(zhuǎn)基因植株。因此需要對(duì)所選用的材料進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)。然而，植物葉片對(duì)卡那霉素的耐受性高于根系[14]，經(jīng)過(guò)高濃度卡那霉素篩選的抗性組培苗很難生根。本研究表明，經(jīng)過(guò)75 mg/L卡那霉素篩選的花生組培苗其生根率僅有31%，如何進(jìn)一步提高其生根率仍需進(jìn)行深入探索。另外發(fā)現(xiàn)，切去抗性苗底端可以顯著提高抗性組培苗生根率。本試驗(yàn)結(jié)果可以為花生建立抗性篩選體系、提高抗性轉(zhuǎn)基因株系生根率提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]許澤永，廖伯壽，晏立英，等. 轉(zhuǎn)基因花生研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)， 2007，29（4）：489-496.

[2]Sarkar T，Thankappan R，Kumar A，et al. Stress inducible expression of AtDREB1A transcription factor in transgenic peanut （Arachis hypogaea L.） conferred tolerance to soil-moisture deficit stress[J]. Front. Plant Sci.，2016，7：935.

[3]覃銘，胡博，劉璨，等. AhNCED1基因轉(zhuǎn)化花生研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2010， 18（3）：277-282.

[4]朱劍光，尉亞輝，郭芝光，等. 乙型肝炎表面抗原基因轉(zhuǎn)化花生及其表達(dá)[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2006，23（6）：665-669.

[5]魏麗奇，邵鳳霞，單雷，等. 花生轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2008，28（10）：124-129.

[6]林榮雙，梁麗琨，肖顯華，等. 花生幼葉為外植體的植株再生系統(tǒng)的建立[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2003，20（3）：307-312.

[7]王航，張西英，陳芳. 不同抗生素對(duì)馬鈴薯組培苗細(xì)菌污染抑制效果比較[J]. 農(nóng)村科技，2014（6）：38.

[8]王成，王義軍，李慧玉，等. 抗生素對(duì)根癌農(nóng)桿菌的抑菌作用及對(duì)新西伯利亞黑楊組培葉片再生的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37（9）：4-7.

[9]李鳳飛，顧德峰. 抗生素對(duì)榆葉梅組培苗抑菌效果的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016，38（1）：53-56.

[10]Chu Y，Deng X Y，F(xiàn)austinelli P，et al. Bcl-xL transformed peanut （Arachis hypogaea L.） exhibits paraquat tolerance[J]. Plant Cell Rep.，2008，27（1）：85-92.

[11]于永明，王軍輝，麻文俊，等. 不同濃度卡那霉素、潮霉素對(duì)楸樹(shù)試管苗生長(zhǎng)的影響[J]. 生物技術(shù)通訊，2014，25（6）：832-836.

[12]Dodo H，Konan K，Viquez O. A genetic engineering strategy to eliminate peanut allergy[J]. Curr. Allergy Asthma Rep.，2005，5（1）：67-73.

[13]王龍龍. 花生二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）基因的克隆與分析[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2010.

[14]王鳳歡，何美敬，楊鑫雷，等. 花生胚小葉對(duì)卡那霉素的敏感性研究[J]. 花生學(xué)報(bào)，2016，45（2）：15-20，32.

[15]郝世俊，隋炯明，喬利仙，等. 花生組培苗嫁接技術(shù)的研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，27（2）：110-113.

[16]李長(zhǎng)生，夏晗，盧金東，等. 利用嫁接提高花生離體再生或轉(zhuǎn)基因苗成活率的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（20）：63-67

[17]喬軍，郭修武，馬麗. 葡萄砧木對(duì)接穗生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J]. 北方果樹(shù)，2006，18（2）：1-3.

[18]朱肖艷. 嫁接對(duì)西瓜品質(zhì)性狀的影響及AFLP多態(tài)性分析[D]. 開(kāi)封：河南大學(xué)，2011.

[19]官春云，黃見(jiàn)良，李栒，等. 芥菜型油菜與甘藍(lán)型油菜嫁接嵌合體的性狀表現(xiàn)[J]. 作物學(xué)報(bào)，2006，32（8）：1244-1247.

[20]王沛，周洲，尹新明，等. 不同質(zhì)量濃度抗生素對(duì)菊花‘綠鸚哥莖段組織培養(yǎng)的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，44（1）：96-99.

[21]王丹，鄒莉，王義，等. 楊樹(shù)對(duì)潮霉素的敏感性研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（1）：47-50.

[22]程貴蘭，蔡智軍. 卡那霉素對(duì)小黑楊花粉植株葉片分化及試管苗生根的影響[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，12（2）：3-4.

[23]蔣衛(wèi)東，唐琳，楊蒼勁，等. 卡那霉素對(duì)川芎愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（11）：85-87.

[24]魏愛(ài)民，張文珠，杜勝利，等. 黃瓜花粉管通道法抗蟲(chóng)基因?qū)爰翱敲顾乜剐院Y選[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（6）：54-57.endprint