曾慶飛，韋 鑫，陳 錫，陳光潔，馬培杰，吳佳海，王小利

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季高頻組培再生體系的優(yōu)化與建立

曾慶飛，韋 鑫，陳 錫，陳光潔，馬培杰，吳佳海，王小利

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

對在貴州地區(qū)廣泛種植的多花黑麥草特高(Loliummultiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麥草四季(L.perenne‘Four seasons’)的成熟種子進行了愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的研究，建立了兩個品種的胚性愈傷組織高頻誘導(dǎo)與再生體系。結(jié)果表明，剝?nèi)コ墒旆N子的穎殼，切除1/3胚乳端，將特高接種于CC+7 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA、四季接種于CC+5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中，在明顯降低組培污染率的同時，能分別得到65.52%和63.55%的最高愈傷組織誘導(dǎo)率；將兩個品種誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移在MS+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA+1.25 mg·L-1CuSO4+1.0 g·L-1CH的繼代培養(yǎng)基上，能促進質(zhì)量較好的Ⅱ型胚性愈傷組織的形成；根據(jù)后續(xù)轉(zhuǎn)化試驗所選用的植物表達載體pCAMBIA 1300的抗性特點，30～40 mg·L-1的潮霉素是兩個品種愈傷組織最佳的篩選劑和臨界濃度；特高的胚性愈傷組織接種在MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1TDZ的培養(yǎng)基上，可以產(chǎn)生86.37%的最高分化率，四季的胚性愈傷組織接種在MS+6.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+5.0 mg·L-1KT的培養(yǎng)基上，能得到85.40%的最高分化率；生根培養(yǎng)基1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IAA能讓兩個品種分化出的不定芽形成100%的生根率；以腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1的混合材料作為營養(yǎng)土，能保證組培再生苗達到99%以上的成活率。優(yōu)化建立的高頻組培再生體系為下一步的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

多花黑麥草特高；多年生黑麥草四季；外植體處理；培養(yǎng)基成分；激素濃度組合；抗生素篩選劑；組培再生體系

黑麥草屬(Lolium)禾本科草本植物，由于其株型外觀優(yōu)美，并具有生長分蘗快，莖葉柔嫩光滑，耐牧性強和綠色期長等優(yōu)點，已成為世界溫帶地區(qū)最重要的冷季型禾草[1]。然而，與其它禾草相比，黑麥草尚存在對干旱、高熱(>35 ℃)和嚴(yán)寒(<-15 ℃)的耐受力較弱，對土壤鹽堿耐受能力中等，抗病蟲能力較差等不足，使其進一步的廣泛栽培和利用受到限制[2]。因此對黑麥草草種進行品質(zhì)改良，培育出抗旱、耐熱、耐瘠薄、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的系列黑麥草優(yōu)良品種，具有重要的生產(chǎn)價值和現(xiàn)實意義。

常規(guī)育種一直是黑麥草新品種選育最主要的方法。但由于黑麥草具有高度的自交不親和性，優(yōu)良基因難以純合穩(wěn)定，采用傳統(tǒng)方法進行遺傳改良存在諸多局限，使得黑麥草新品種的選育進展一直很緩慢。采用基因工程手段對已有黑麥草品種進行抗性改良，縮短育種周期，加快育種進程，已成為當(dāng)前最有效而快捷的途徑之一[3]。通過基因轉(zhuǎn)移進行植物遺傳改良，有效的離體再生體系是一個很重要的環(huán)節(jié)，成功的基因轉(zhuǎn)化必須依賴于良好的植物遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立。在現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，與懸浮細(xì)胞和原生質(zhì)體相比，愈傷組織由于具有較高的再生頻率、良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性以及對農(nóng)桿菌侵染和篩選劑均具有敏感性等特點，已經(jīng)被廣泛用作遺傳轉(zhuǎn)化的主要受體[4]。

國內(nèi)外針對黑麥草的組織培養(yǎng)與外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)開展了大量的研究，也已建立起多種植株再生體系和包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)在內(nèi)的多種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)[5]，但在具體的實踐過程中對于組培再生體系尚存在一些亟待解決的問題。首先，種子誘導(dǎo)的愈傷組織污染難于控制。種子存在種殼內(nèi)外污染物，特別是殼內(nèi)細(xì)菌和真菌難以徹底殺滅。目前國內(nèi)外對黑麥草組織培養(yǎng)的研究主要集中在外植體的篩選及培養(yǎng)基的配比上，而對組織培養(yǎng)中污染率的控制缺少研究[6]。其次，胚性愈傷組織誘導(dǎo)頻率較低。同大多數(shù)禾本科牧草一樣，黑麥草組織培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生兩類形態(tài)上明顯不同的愈傷組織，一類是胚性愈傷組織，再生能力較強；另一類是非胚性愈傷組織，植株再生頻率極低。在組培實際操作中遇到的一個普遍問題是，以最為常用的成熟種子(胚)作為外植體，誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織的比例都非常低[7]。如何誘導(dǎo)愈傷組織并對其進行繼代和改造，促進胚性愈傷組織的產(chǎn)生和增殖，是一個需要深入研究的技術(shù)環(huán)節(jié)。第三，植株再生頻率不穩(wěn)定。從黑麥草胚性愈傷組織誘導(dǎo)分化形成的再生植株頻率高低不同，可重復(fù)性差。因各種原因造成很多試驗重復(fù)后無法得到相同結(jié)果，即使對同一個品種，不同的研究者得出的結(jié)果也不盡相同，甚至是矛盾的結(jié)論[8-9]。這說明黑麥草再生體系的方案還不夠完善。

本研究選擇在貴州地區(qū)種植較為普遍的多花黑麥草品種特高(L.multiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麥草品種四季(L.perenne‘Four seasons’)，針對黑麥草在建立愈傷組織再生體系培養(yǎng)過程中存在的組培污染、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、植株再生頻率不穩(wěn)定等主要問題，開展了外植體處理、組培污染率控制、基本培養(yǎng)基及分化培養(yǎng)基種類、激素種類與濃度配比以及培養(yǎng)條件等內(nèi)容的研究，篩選和優(yōu)化了兩個黑麥草品種愈傷組織再生體系的系列條件，建立起兩個品種外源基因植入的高頻植株的再生體系，以期為下一步的遺傳轉(zhuǎn)化奠定可靠的物質(zhì)及技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用在貴州地區(qū)種植較為廣泛的一年生黑麥草品種特高和多年生黑麥草品種四季的成熟種子作為外植體材料。特高購于貴陽霖卉園林綠化有限公司，四季由貴州省草業(yè)研究所保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的前處理 兩個品種的成熟種子均按兩種方式分別進行前處理，一組保留穎殼，另一組人工剝?nèi)シf殼，使用裸露種子。

在選用植物種子，特別是有穎殼的種子，作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的過程中，組培污染是一個很普遍而且難于控制的問題[6]，這直接影響到后續(xù)試驗的正常進行。種子消毒的常規(guī)方法一般是先將種子作浸泡沖洗處理，然后用70%～75%酒精消毒1～2 min，再用0.1%升汞浸泡20～30 min，或者用10%～20%次氯酸鈉浸泡30～60 min。無論選用何種消毒液，處理時間越短，消毒越不徹底，而消毒時間越長，對種子內(nèi)部組織的損傷也會越大。為解決這一問題，本研究將兩個品種的黑麥草種子均作了剝?nèi)シf殼和保留穎殼兩種方式的前處理。先將有殼的完整種子浸泡沖洗后，同時將完整種子和裸露種子經(jīng)75%的酒精消毒2 min，0.1%升汞浸泡20 min后，一半裸露種子切除1/3胚乳端，分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計3種外植體的污染數(shù)。

1.2.2 外植體的消毒預(yù)處理 將保留穎殼的成熟種子于4 ℃條件下浸泡過夜，去掉漂浮種子，將下層飽滿種子用流水沖洗干凈后濾干。將浸泡沖洗后的完整種子與剝?nèi)シf殼的裸露種子分別用75%的酒精消毒2 min，無菌水沖洗5次后再用0.1%升汞浸泡20 min，無菌水沖洗10次。完整種子直接接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，裸露種子一部分直接接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，另一部分用解剖刀先切掉1/3的胚乳端后再接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.3 培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基[10]：添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂8 g·L-1。CC培養(yǎng)基[11]：添加蔗糖20 g·L-1，甘露醇36.43 g·L-1，維生素C 0.06 g·L-1，瓊脂8 g·L-1。兩種培養(yǎng)基均加入2,4-D(0、1、3、5、7、9 mg·L-1)和6-BA(0、0.5、1.0 mg·L-1)，各自組成18種不同激素濃度的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表1)。

繼代培養(yǎng)基：① MS+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA；② MS+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA+1.25 mg·L-1CuSO4+1.0 g·L-1CH(酸水解酪蛋白)。

分化培養(yǎng)基：在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入6-BA(2.0、4.0、6.0 mg·L-1)、NAA(0.05、0.1、0.3、0.5 mg·L-1)、KT(0、2.5、5.0 mg·L-1)和TDZ(0、0.1、0.3 mg·L-1)，組合成12種不同激素濃度配比的分化培養(yǎng)基(表2)。

壯苗培養(yǎng)基：無激素MS培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)基：1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IAA。

1.2.4 愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng) 將經(jīng)過消毒處理的兩個黑麥草品種的完整種子以及去殼種子中的切除1/3胚乳與全裸種子分別接種于不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合，每個150 mL三角瓶的50 mL培養(yǎng)基上接種20～25粒種子，每個處理3次重復(fù)，置于(26±1) ℃黑暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織。7 d后開始統(tǒng)計種子的出愈率，每隔5 d記錄一次，直至接種后第40天。

表1 不同激素濃度的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Table 1 The callus inducing media with different concentrations of hormones

表2 不同激素濃度配比的分化培養(yǎng)基Table 2 The differentiation media with different concentration ratio of hormones

40 d后將各處理誘導(dǎo)出的愈傷組織一分為二，分別轉(zhuǎn)移至兩種繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每次繼代培養(yǎng)時間25～30 d，繼代培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)培養(yǎng)相同。

1.2.5 抗生素臨界濃度的確定 由于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化所選用的載體是經(jīng)貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實驗室改造后的pCAMBIA 1300植物表達載體，該載體具有潮霉素(hygromycin，Hyg)和卡那霉素(kanamycin，Kan)的抗性，因此所選用的抗生素篩選劑為Hyg和Kan。

測定方法：將繼代培養(yǎng)形成的同一批次相同形態(tài)的胚性愈傷組織放入含不同濃度篩選劑的MS培養(yǎng)基上，并以在不含篩選劑培養(yǎng)基上的愈傷組織作對照。記錄每一處理愈傷組織的初始質(zhì)量(W0)，培養(yǎng)40 d后再記錄每一處理愈傷組織的質(zhì)量(Wt)，然后分別計算愈傷組織質(zhì)量增長率和愈傷組織相對質(zhì)量增長率(對應(yīng)濃度抗生素對愈傷組織的抑制效果)。

1.2.6 愈傷組織分化與植株再生 將繼代培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入12組分化培養(yǎng)基中，每個處理3次重復(fù)。在(25±1) ℃、光照時間12 h·d-1、光強2 000 lx的培養(yǎng)室中進行分化培養(yǎng)。連續(xù)觀察分化情況，直至分化長出無根不定芽，統(tǒng)計分化率。短于1 cm的不定芽首先置于壯苗培養(yǎng)基上壯苗，7 d后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中。當(dāng)幼根在生根培養(yǎng)基中長至2 cm左右時，揭開瓶蓋煉苗2～3 d后，移栽至盛有營養(yǎng)土(腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1)的花缽中。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗過程中對外植體污染率、愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷分化率、生根率和植株再生率進行了嚴(yán)格統(tǒng)計。每個處理3次重復(fù)，計算總平均數(shù)；每個重復(fù)包含20～25個外植體、愈傷組織或分化苗。

統(tǒng)計項目分別按下列公式計算：

外植體污染率=(外植體受污染數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)的愈傷組織總數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

愈傷組織質(zhì)量增長率(r)=(Wt-W0)×100%；

愈傷組織相對質(zhì)量增長率(R)=r/r0×100%(r0為對照愈傷組織的質(zhì)量增長率)；

愈傷組織分化率=(有芽形成的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%；

生根率=(有根形成的不定芽塊數(shù)/接種的不定芽總數(shù))×100%；

植株再生率=(分化成植株的愈傷組織塊數(shù)/轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基的愈傷組織塊數(shù))×100%。

對各組培處理的誘導(dǎo)率、分化率等數(shù)據(jù)，采用Excel和SPSS數(shù)據(jù)處理軟件分別進行統(tǒng)計分析和顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體處理方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1 不同前處理方式對外植體污染率的影響 統(tǒng)計結(jié)果(表3)表明，無論是多花黑麥草特高，還是多年生黑麥草四季的種子，直接用完整種子作為外植體，在誘導(dǎo)愈傷組織過程中的污染率均在42%以上，而提前將種子的穎殼剝除后，采用相同的消毒處理方法，切割與未切割種子的污染率均降低到了10%以下，去殼與保留穎殼相比，差異極顯著(P<0.01)。說明使用剝除穎殼的黑麥草種子作為外植體，能明顯降低組培過程中的污染率。

2.1.2 不同種子處理方式對愈傷組織誘導(dǎo)頻率的影響 將3種經(jīng)不同前處理的種子分別接種于不同激素濃度組合的MS和CC培養(yǎng)基上，15 d后即有直徑2 mm左右的淡黃色愈傷顆粒出現(xiàn)，40 d后愈傷組織直徑達4～5 mm(表4)?？梢钥闯?，特高和四季兩個品種裸露種子和切除1/3胚乳種子均比完整種子的出愈數(shù)要高，誘導(dǎo)率達到顯著差異(P<0.05)和極顯著(P<0.01)，這可能是完整種子污染率較高的原因。而在裸露種子中，切除胚乳端的與未經(jīng)切割的兩者之間的種子出愈率呈現(xiàn)出極顯著差異，說明種子經(jīng)適當(dāng)切割后，能明顯提高愈傷組織的誘導(dǎo)頻率。

2.2 培養(yǎng)基、激素濃度對愈傷組織誘導(dǎo)頻率的影響

2.2.1 不同基本培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率 兩個品種在兩種培養(yǎng)基中總的愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)量及誘導(dǎo)頻率的統(tǒng)計結(jié)果(表5)顯示，一年生黑麥草特高與多年生黑麥草四季在MS和CC培養(yǎng)基中都能正常誘導(dǎo)出愈傷組織，但CC培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率明顯高于MS。特高在兩種培養(yǎng)基間呈顯著差異(P<0.05)，而四季則呈極顯著差異(P<0.01)。表明CC培養(yǎng)基更適合于特高和四季兩個黑麥草品種愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2.2 2,4-D與6-BA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將特高和四季經(jīng)過處理的種子分別接種在含有不同2,4-D與6-BA濃度的MS及CC培養(yǎng)基中，根據(jù)40 d后對各培養(yǎng)基中種子出愈數(shù)量的統(tǒng)計和差異顯著性測驗，分別得到了2,4-D與6-BA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響關(guān)系(表6)。

表3 種子不同前處理方式對組培污染率的影響Table 3 Effect of different treatments of seeds on contamination rate during tissue culture

注：不同大寫字母和小寫字母分別表示不同種子處理方式間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different capital letters and lowercase letters indicate significant difference among different treatments of seeds at 0.01 and 0.05 levels, respectively; similarly for the following tables.

表4 不同前處理方式對愈傷種子誘導(dǎo)率的影響Table 4 Effect of different treatments of seeds on callus ratio

表5 不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Table 5 Effect of different media on callus induction of ryegrass

表6 2,4-D和6-BA濃度對黑麥草愈傷種子誘導(dǎo)率的影響Table 6 Effect of concentration of 2,4-D and 6-BA on callus induction of ryegrass

統(tǒng)計結(jié)果表明，無2,4-D培養(yǎng)基中的兩個黑麥草品種均不能誘導(dǎo)形成愈傷組織。在1～7 mg·L-1的范圍內(nèi)，隨著2,4-D濃度的增加，出愈率基本呈逐漸增加的趨勢，當(dāng)2,4-D濃度升至9 mg·L-1時，愈傷組織誘導(dǎo)率反而有所降低。多花黑麥草特高在7 mg·L-1的2,4-D濃度時，愈傷組織誘導(dǎo)率達到最大值(46.58%)，與5 mg·L-1時的誘導(dǎo)率呈顯著差異(P<0.05)，與1和3 mg·L-1時的誘導(dǎo)率達到極顯著差異(P<0.01)，但與9 mg·L-1時的誘導(dǎo)率差異不顯著(P>0.05)。多年生黑麥草四季在5 mg·L-1的2,4-D濃度時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高(44.23%)，但與7 mg·L-1時的誘導(dǎo)率差異不顯著，而與1、3和9 mg·L-1時的出愈率差異均達到極顯著水平。

6-BA濃度與愈傷組織誘導(dǎo)關(guān)系的統(tǒng)計結(jié)果表明(表6)，在3個濃度梯度的設(shè)置中，無6-BA僅含有2,4-D的培養(yǎng)基也能正常誘導(dǎo)出愈傷組織，但兩個品種的黑麥草都是在6-BA濃度為0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率最高，而且6-BA培養(yǎng)基都與無6-BA培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率呈極顯著差異(P<0.01)。當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA的濃度達到1.0 mg·L-1時，出愈率反而有所降低。其中特高1.0與0.5 mg·L-1時的誘導(dǎo)率呈極顯著差異，四季1.0與0.5 mg·L-1的誘導(dǎo)率呈顯著差異(P<0.05)。說明6-BA的濃度只能在一個較小范圍內(nèi)有助于愈傷組織的誘導(dǎo)，超過一定數(shù)量后反而會產(chǎn)生抑制作用。

2.2.3 不同激素濃度組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 在設(shè)計的18種不同激素濃度組合的培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率出現(xiàn)不同程度的差異(表7)。對于多花黑麥草特高，激素組合7 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA 的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，比次之的9 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA組合的誘導(dǎo)率高1.55百分點，與5mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA組合的誘導(dǎo)率之間差異顯著(P<0.05)；對于多年生黑麥草四季，激素組合5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA具有最大出愈率，比稍低的7 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA組合的出愈率高2.07百分點，與9 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA 組合的誘導(dǎo)率差異顯著(P<0.05)。同時觀察還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA的濃度偏高時，愈傷組織的生長勢還會變差。

表7 不同激素濃度組合誘導(dǎo)率差異顯著性測驗Table 7 Significant difference at 0.01 and 0.05 level in callus ratio of different concentrations and combinations of hormones

綜合種子處理方式、培養(yǎng)基種類和激素濃度組合對愈傷組織誘導(dǎo)頻率及生長質(zhì)量的影響結(jié)果，篩選出兩個黑麥草品種的最佳愈傷組織誘導(dǎo)條件分別為：多花黑麥草特高，以剝?nèi)シf殼后切除1/3胚乳端的種子作為外植體，接入CC+7 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；多年生黑麥草四季，以剝?nèi)シf殼后切除1/3胚乳端的種子作為外植體，以CC+5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.3 培養(yǎng)基成分對愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

無論是以MS還是CC作為基本培養(yǎng)基，兩個品種的黑麥草所誘導(dǎo)出的愈傷組織都表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。根據(jù)Armstrong[12]的標(biāo)準(zhǔn)可以將它們分為3種類型:Ⅰ型,質(zhì)地疏松，生長較快，部分愈傷組織表面呈白色片層狀，不易長期繼代；Ⅱ型,結(jié)構(gòu)致密，生長適中，呈顆粒狀，長期繼代仍有胚性；Ⅲ型,結(jié)構(gòu)粘軟，呈白色透明或半透明水浸狀，生長緩慢，容易繼代培養(yǎng)，但幾乎喪失分化能力。本研究在誘導(dǎo)過程中觀察發(fā)現(xiàn)，在2,4-D濃度為3～7 mg·L-1、6-BA濃度為0和0.5 mg·L-1時，誘導(dǎo)出的多為Ⅱ型愈傷組織；當(dāng)2,4-D濃度為9 mg·L-1、6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，則Ⅲ型愈傷組織所占比例較大。研究將誘導(dǎo)出的兩個品種的Ⅱ型愈傷組織挑選出來，一分為二，分別接種于所設(shè)計的兩種繼代培養(yǎng)基上，以比較兩種培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)效果。

每次繼代培養(yǎng)時間25 d，次繼代培養(yǎng)后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)基上的愈傷組織在顆粒大小和質(zhì)量上都有不同程度的增加，并形成了不同比例的結(jié)構(gòu)緊密、淡黃色或乳白色、表面有乳狀突起的Ⅱ型胚性愈傷組織。其中在1號繼代培養(yǎng)基(MS+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA)上的Ⅱ型胚性愈傷組織不到50%，乳白色顆粒較多(圖1A)；2號繼代培養(yǎng)基(MS+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA+1.25 mg·L-1CuSO4+1.0 g·L-1CH)上的Ⅱ型胚性愈傷組織占60%以上，且色澤鮮艷，淡黃色顆粒較多(圖1B)。說明在繼代培養(yǎng)過程中，適當(dāng)濃度的硫酸銅和酸水解酪蛋白有助于胚性愈傷組織的形成。

2.4 抗生素臨界濃度的確定

利用未轉(zhuǎn)入外源基因的特高和四季同一批次的胚性愈傷組織進行抗生素不同濃度的抑制效果測定。統(tǒng)計結(jié)果表明(表8)，Hyg與Kan對兩個品種愈傷組織的生長抑制作用有所不同。Hyg的抑制作用明顯較大，在低濃度條件下即可使愈傷組織的質(zhì)量增長明顯受阻；而Kan在高達1 000 mg·L-1的濃度時，愈傷組織依然有20%以上的增長水平。因此，在本研究的后續(xù)轉(zhuǎn)化試驗中，適合選用Hyg作為篩選劑來進行轉(zhuǎn)化子的篩選，而且篩選條件以40mg·L-1的濃度培養(yǎng)40 d左右或者30 mg·L-1的濃度培養(yǎng)60 d左右為宜。

2.5 不同激素和激素組合對愈傷組織分化不定芽的影響

選擇多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季兩個品種在抗性培養(yǎng)基上生長良好的淡黃色、質(zhì)地致密、呈顆粒狀堆積的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到12種不同激素濃度與激素配比的分化培養(yǎng)基中，每一培養(yǎng)基接種20顆愈傷組織，每種培養(yǎng)基3次重復(fù)，在光暗交替條件下培養(yǎng)。5 d后即有綠色芽點分化，20 d后逐漸形成不定芽(圖2)。30 d后統(tǒng)計兩個品種愈傷組織的分化率(表9)，可以看出，多花黑麥草特高在10號培養(yǎng)基(MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1TDZ)中的分化率最高，達86.37%，與其余9種培養(yǎng)基的分化率均呈現(xiàn)出顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異；而多年生黑麥草四季則是在9號培養(yǎng)基(MS+6.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+5.0 mg·L-1KT)中具有最大的分化率(85.40%)，也同其余9種培養(yǎng)基的分化率達到了顯著或極顯著差異水平。說明6-BA與NAA對黑麥草的愈傷分化都是至關(guān)重要的，而且不同品種對兩者濃度的最佳組合表現(xiàn)出不同的要求；同時，單獨添加TDZ與KT能分別提高特高和四季愈傷組織的分化率。

圖1 分別在1號培養(yǎng)基(A)和2號培養(yǎng)基(B)上繼代培養(yǎng)的黑麥草愈傷組織 Fig. 1 The subcultured callus of ryegrass on medium No. 1(A) and on medium No. 2(B) whose compositions have been provided in “Materials and methods”

黑麥草Lolium潮霉素Hygromycin(Hyg)濃度Concentration/mg·L-1相對質(zhì)量增長率Growthrateofrelativequality/%卡那霉素Kanamycin(Kan)濃度Concentration/mg·L-1相對質(zhì)量增長率Growthrateofrelativequality/%特高Tetragold1054.30±1.48Aa20082.53±0.48Aa2033.09±0.85Bb40073.04±0.51Bb3015.73±0.65Cc60069.58±1.41Bb400.86±0.19Dd80051.27±0.78Cc500100023.09±1.08Dd四季Fourseasons1052.27±0.71Aa20083.16±1.66Aa2034.10±0.85Bb40074.33±0.61Bb3016.55±0.41Cc60066.35±1.38Cc401.13±0.15Dd80052.10±0.78Dd500100022.36±0.61Ee

注：表中數(shù)據(jù)取自篩選40 d后的統(tǒng)計結(jié)果。

Note: The data were collected after 40 days of screening.

2.6 再生植株的獲得

在分化培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計分化率時，特高和四季兩個品種均形成有大小不同的不定芽。將大于2cm的不定芽直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，短于2 cm的不定芽先植入壯苗培養(yǎng)基上壯苗，7 d后再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。在生根培養(yǎng)基中的不定芽10 d左右即開始生根，30 d后所有幼苗都長出了2～5 cm的幼根(圖3)，生根率100%，說明所選用的生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.5 mg·L-1NAA +0.5 mg·L-1IAA)能有效促進不定芽幼根的形成。

圖2 多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季胚性愈傷組織分化形成的不定芽Fig. 2 The adventitious buds of Tetragold annual ryegrass and Four seasons perennial ryegrass differentiating from embryogenic callus

表9 不同培養(yǎng)基中愈傷組織的分化率Table 9 Differentiation rates of embryogenic callus on different media

長出幼根的不定芽在組培瓶內(nèi)生長很快。當(dāng)再生苗株高長至6～8 cm時，在15～25 ℃室溫條件下揭開瓶蓋煉苗2～3 d后，從瓶內(nèi)小心取出，清水洗凈瓊脂，移栽至盛有營養(yǎng)土(腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1)的花缽中，澆足定根水。7 d后統(tǒng)計，再生苗移栽成活率為99%。其中獲得多花黑麥草特高的盆栽再生苗236株，平均植株再生率63.16%；獲得多年生黑麥草四季的盆栽再生苗184株，平均植株再生率59.37%。

圖3 多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季不定芽形成的幼根Fig. 3 Rootlets of Tetragold annual ryegrass and Four seasons perennial ryegrass forming from adventitious buds

3 討論與結(jié)論

自20世紀(jì)70年代開始，隨著基因工程技術(shù)的興起與蓬勃發(fā)展，植物高頻再生體系的研究工作被廣泛開展，并相繼建立起了原生質(zhì)體再生系統(tǒng)、愈傷組織再生系統(tǒng)、懸浮和生殖細(xì)胞再生系統(tǒng)等多種遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。對于禾本科牧草這類單子葉植物來說，由器官直接分化形成再生植株的難度較大，細(xì)胞懸浮系的建立和原生質(zhì)體的再生也十分困難，選用愈傷組織再生系統(tǒng)，則具有外植體材料來源廣泛、愈傷組織擴繁量大和再生能力較為穩(wěn)定等優(yōu)點，被認(rèn)為是一種較為理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)[13]。在禾本科牧草黑麥草愈傷組織的誘導(dǎo)中，成熟胚、胚軸、胚根和幼穗都可以用來作為外植體，但由于成熟種子取材方便且不受季節(jié)影響，已成為被研究者們普遍選用的外植體[14]。黑麥草和高羊茅(Festucaarundinacea)這一類帶有穎殼的牧草種子，其穎殼內(nèi)外不可避免的會有大量微生物的附集，在作為外植體的愈傷誘導(dǎo)時不容易徹底消毒，而消毒液較長時間的浸泡又會損傷種子內(nèi)部組織，進而影響愈傷組織的誘導(dǎo)效果，因而組培污染成了一個較難控制的普遍現(xiàn)象。本研究試著將一部分黑麥草的穎殼提前剝除成為裸露種子，與保留穎殼的完全種子采用相同的消毒處理方法，分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。結(jié)果證明，無論切除1/3胚乳與否的裸露種子，其外植體污染率都明顯小于完整種子，這為后續(xù)試驗提供了一個良好的先決保障。去除穎殼雖然需要增加工作量，但它可以提前準(zhǔn)備，無需人工勞動的集中投入，因此是控制組培污染的一種有效手段。

黑麥草成熟種子雖然是愈傷誘導(dǎo)的一種常用外植體，但完整種子的愈傷組織誘導(dǎo)率普遍偏低[15]。本研究通過將一部分裸露種子在無菌條件下切掉1/3的胚乳端，結(jié)果與非切割裸露種子相比，大大提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率。種子切割另有切留胚端半粒種子、豎劃種子等方法的報道[16]，但無論采取何種切割方法，愈傷誘導(dǎo)率都能得到顯著增加。可能的原因是，切割打開了種皮的包被，增加了種子對激素的吸收，同時胚芽受損后在抑制種子萌發(fā)的同時能刺激愈傷組織的形成。只是帶殼切種依然容易產(chǎn)生組培污染的問題[17]，本研究試用裸種切割的方法，既有效控制了污染現(xiàn)象，又明顯提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率。所以外植體的前處理方式對于愈傷組織的誘導(dǎo)也是一個不可忽視的重要因素。

外植體在得到適當(dāng)?shù)那疤幚硪院?，培養(yǎng)基成分就成了愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵要素。在眾多培養(yǎng)基類型中本研究選用了MS與CC兩種基本培養(yǎng)基。試驗結(jié)果顯示，一年生黑麥草特高與多年生黑麥草四季在CC培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率都明顯高于MS。原因可能是，CC培養(yǎng)基中添加的甘露醇能維持培養(yǎng)基中的高滲透壓，連同添加的維生素C，在促進愈傷組織形成的同時，能使愈傷生長更為致密。在一定的基本培養(yǎng)基中，激素組合與激素濃度是最重要的愈傷組織誘導(dǎo)因子。眾多的研究提出，作為生長素類的2,4-D在愈傷組織誘導(dǎo)中是必不可少的一種外源激素[18]。本研究設(shè)置了0～9 mg·L-1共6個水平的2,4-D濃度，結(jié)果表明，無2,4-D的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)愈傷組織，而在1～9 mg·L-1的范圍內(nèi)，總體趨勢是，愈傷組織誘導(dǎo)率會隨著2,4-D濃度的增加而增加，但特高的最佳誘導(dǎo)濃度是7 mg·L-1，四季的最佳誘導(dǎo)濃度則是5 mg·L-1，說明2,4-D的濃度也并非越高越好。6-BA在愈傷組織誘導(dǎo)中的作用有著不同的報道結(jié)果。如，多年生黑麥草愛神特在6-BA濃度為0時，愈傷誘導(dǎo)率反而最高[19]；在用大穗黑麥草(Loliumgrandispicum)成熟種子誘導(dǎo)愈傷時發(fā)現(xiàn)，在0～1.0 mg·L-1的范圍內(nèi)，6-BA濃度越大，愈傷誘導(dǎo)率越高[20]；以紫花苜蓿(Medicagosativa)的下胚軸為材料進行試驗，參試4個品種的6-BA濃度在0.5～2.0 mg·L-1的范圍內(nèi)濃度越大，愈傷誘導(dǎo)效果越好[21]。說明作為細(xì)胞分裂素類的6-BA，在愈傷組織誘導(dǎo)中的重要性以及最佳濃度范圍會因植物種類及基因型的不同而不同。魏樹強等[9]以多年生黑麥草‘高帽2號’(L.perenne‘Top Hat 2’)的穎果為外植體，通過設(shè)計二因素四水平的正交試驗，獲得了MS+5 mg·L-12,4-D+0.03 mg·L-16-BA的優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率達到68.7%，而本研究針對多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季所獲得的優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為CC+7 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA與CC+5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA，激素種類組合與之相同，但基本培養(yǎng)基種類與激素濃度組合以及所得到的最高愈傷組織誘導(dǎo)率卻不完全相同。這進一步證實了不同基因型的黑麥草品種對應(yīng)著不同的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分，且最高愈傷組織誘導(dǎo)率也存在一定差異。

在愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中，本研究只選用了激素濃度較低的組合MS+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA 作為繼代培養(yǎng)基，但另外在該組合培養(yǎng)基中添加了1.25 mg·L-1的硫酸銅以及1.0 g·L-1的酸水解酪蛋白(CH)作為對比。關(guān)于添加物對愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響關(guān)系還鮮有報道。本研究結(jié)果證明，培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的CuSO4和CH后，不但能增加胚性愈傷組織形成的數(shù)量，還能提高愈傷組織的質(zhì)量，CuSO4和CH是繼代培養(yǎng)基中的有益成分。

通過繼代培養(yǎng)形成成熟的胚性愈傷組織，目的是為了獲得外源基因的受體材料而進行遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子的篩選首先需要通過抗生素的壓力選擇，因此針對轉(zhuǎn)化材料進行相應(yīng)抗生素臨界濃度的預(yù)先測定，是保證后續(xù)轉(zhuǎn)化試驗成功進行的環(huán)節(jié)之一。本研究后面將要進行的遺傳轉(zhuǎn)化試驗所選用的載體是經(jīng)過貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實驗室改造過的pCAMBIA 1300植物表達載體，該載體具有Hyg和Kan抗性，因此本研究只選擇它們作為抗生素篩選劑。通過對愈傷組織的生長抑制作用測定發(fā)現(xiàn)，本研究中30～40 mg·L-1的Hyg是最佳的篩選劑和臨界濃度，這一結(jié)果與陳智勇等[22]關(guān)于Hyg和Kan對多年生黑麥草愈傷組織抑制作用的研究結(jié)論是一致的。

分化培養(yǎng)基中激素組合與濃度配比是影響愈傷組織分化率的關(guān)鍵因素[23]。在參考大量相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，本研究設(shè)計了12種激素濃度梯度的分化培養(yǎng)基組合。從培養(yǎng)基組合之間分化率的差異可以看出，無6-BA的培養(yǎng)基其分化率相對較低，6-BA與NAA的濃度配比對分化率的高低起著主要作用，而且不同的品種對這一濃度配比有著不同的要求。另外，本研究中多花黑麥草特高的最適培養(yǎng)基中含有細(xì)胞分裂素活性很強的TDZ，KT則能促進品種四季愈傷組織的分化，而將TDZ與KT同時加入培養(yǎng)基后促分化效率反而有所降低。TDZ在一些豆科植物愈傷組織的分化中應(yīng)用較多，并能產(chǎn)生良好的促分化效果[24]，但在禾本科牧草中的應(yīng)用報道卻很少。

在生根誘導(dǎo)過程中，本研究選用的是只含有0.5 mg·L-1低濃度NAA和IAA的1/2MS培養(yǎng)基，并獲得了良好的生根效果。事實上，黑麥草組培苗在沒有外源激素供給的情況下也能生根，只是生成的根系質(zhì)量較差[25]。加入適量的外源激素，能誘導(dǎo)形成粗壯的根系，并促進植株的生長發(fā)育。將組培苗移栽至花缽中時，本研究使用的營養(yǎng)土除含有腐殖土和蛭石外，還添加了1/3的砂壤土。這不僅沒有影響移栽成活率，還能保持移栽后的再生苗具有較快的生長勢。

References:

[1] Healy M G,Ryan P C,Fenton O,Peyton D P,Wall D P,Morrison L.Bioaccumulation of metals in ryegrass (LoliumperenneL.) following the application of lime stabilised,thermally dried and anaerobically digested sewage sludge.Ecotoxicology and Environmental Safety,2016,130:303-309.

[2] 謝宏偉，徐慶國，李陽．黑麥草高溫脅迫抗性與抗旱性遺傳育種研究進展．作物研究，2011，25(1)：89-94． Xie H W,Xu Q G,Li Y.Research progress of genetic breeding of high temperature resistance stress and drought resistance ofLoliumperenne.Crop Research,2011,25(1):89-94.(in Chinese)

[3] 馬欣榮，劉華玲，談心．植物生物技術(shù)在黑麥草遺傳改良中的應(yīng)用．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2007，13(6)：881-887． Ma X R,Liu H L,Tan X.Application of plant biotechnology in ryegrass genetic improvement.Chinese Journal of Applied and Environmental Biology,2007,13(6):881-887.(in Chinese)

[4] 金忠民，沙偉，張艷馥，孫微，劉文靖．羊茅種子愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系的建立．草業(yè)科學(xué)，2010，27(10)：60-63． Jin Z M,Sha W,Zhang Y F,Sun W,Liu W J.Establishment of regeneration system and callus inducing ofFestucaovinaseeds.Pratacultural Science,2010,27(10):60-63.(in Chinese)

[5] Altpeter F.Perennial ryegrass (LoliumperenneL.).Methods in Molecular Biology,2006,344:55-64.

[6] 劉占彬，袁慶華．多花黑麥草種子外植體組織培養(yǎng)滅菌方法研究.草地學(xué)報，2009，17(4)：474-479． Liu Z B,Yuan Q H.Study on the sterilization methods in tissue culture of Italian ryegrass seed explants.Acta Agrestia Sinica,2009,17(4):474-479.(in Chinese)

[7] 杜雪玲，張振霞，劉萍，楊中藝，符義坤．2,4-D和6-BA對多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)影響的研究.草原與草坪，2005(3)：49-51． Du X L,Zhang Z X,Liu P,Yang Z Y,Fu Y K.The effect of 2,4-D and 6-BA on callus induction of perennial ryegrass.Grassland and Turf,2005(3):49-51.(in Chinese)

[8] 文沛玲，瞿楊，葉光明，楊秉健，杜小姣．不同濃度6-BA對黑麥草種子出愈率的影響．草原與草坪，2014，34(3)：20-23，30． Weng P L,Qu Y,Ye G M,Yang B J,Du X J.Effects of 6-BA with different concentrations on callus induction rate of ryegrass seeds.Grassland and Turf,2014,34(3):20-23，30.(in Chinese)

[9] 魏樹強，錢永強，劉俊祥，孫振元．多年生黑麥草再生體系的建立．廣西植物，2015，35(5)：709-714． Wei S Q,Qian Y Q,Liu J X,Sun Z Y.Establishment of tissue regeneration system ofLoliumperenne.Guihaia,2015,35(5):709-714.(in Chinese)

[10] Murashige T,Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Journal of Plant Physiology,1962,15:473-479.

[11] Portrykus I,Harms C T,Lorz H.Callus formation from cell culture protoplasts of corn.Theoretical and Applied Genetics,1979,54:209-214.

[12] Armstrong C L.Establishment and maintenance of firable,embryo genic maize callus and the involvement of L-proline.Planta,1985,164:207-214.

[13] 陳季琴，韓烈保，楊純奇，李雪．不同外植體對多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的影響.草原與草坪，2005(4)：42-46． Chen J Q,Han L B,Yang C Q,Li X.Effect of different explants on callus induction of perennial ryegrass.Grassland and Turf,2005(4):42-46.(in Chinese)

[14] 臧文靜，陳瑩，李青，茍孝琴，武炳超，楊盛婷，張銳，張新全，黃琳凱．雜交狼尾草不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)．草業(yè)科學(xué)，2015，32(9)：1451-1456． Zang W J,Chen Y,Li Q,Gou X Q,Wu B C,Yang S T,Zhang R,Zhang X Q,Huang L K.Tissue culture differentiation and callus induction of different explant fromPennisetumamericanum×P.purureum.Pratacultural Science,2015,32(9):1451-1456.(in Chinese)

[15] Akashi R,Hashimoto A,Adaehi T.Plant regeneration from seed-drived embryogenic callus and cell suspension cultures of bahiagass.Plant Science,1993,90:73-89.

[16] 楊茹，袁慶華，曹致中，王鎖民．2,4-D和BA對黑麥草不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響．中國草地學(xué)報，2008，30(4)：34-39． Yang R,Yuan Q H,Cao Z Z,Wang S M.Effect of different explants on callus induction and differentiation of perennial ryegrass.Chinese Journal of Grassland,2008,30(4):34-39.(in Chinese)

[17] 蔡能，易自力，陳智勇，劉清波，蔣建雄．多年生黑麥草高頻再生體系的建立及優(yōu)化．中國草地學(xué)報，2007，29(4)：45-49． Cai N,Yi Z L,Chen Z Y,Liu Q B,Jiang J X.Establishment and modification of high frequency regeneration system of perennial ryegrass (LoliumperenneL.).Chinese Journal of Grassland,2007,29(4):45-49.(in Chinese)

[18] 釧秀娟，陳彩虹，羅麗娟．熱研5號柱花草高頻、優(yōu)質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)．草業(yè)科學(xué)，2015，32(1)：78-84． Chuan X J,Chen C H,Luo L J.Callus induction ofStylosanthesguianensiscv.Reyan No.5.Pratacultural Science,2015,32(1):78-84.(in Chinese)

[19] 段碧華，韓寶平，高遐虹，孫月梅．兩種冷季型草坪草愈傷組織誘導(dǎo)研究初報．北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2005，20(1)：65-67． Duan B H,Han B P,Gao X H,Sun Y M.Studies on callus induction of two cool-season turfgrass cultivars.Journal of Beijing Agricultural College,2005,20(1):65-67.(in Chinese)

[20] 余澤高，黃喜梅．大穗黑麥草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004(12)：7-10． Yu Z G,Huang X M.Studies on callus induction and differentiation of mature seed ofLoliumgrandispicum.Henan Agricultural Sciences,2004(12):7-10.(in Chinese)

[21] 馬暉玲，盧欣石，曹致中，葛軍．紫花苜蓿不同栽培品種植株再生的研究．草業(yè)學(xué)報，2004，13(6)：99-105． Ma H L,Lu X S,Cao Z Z,Ge J.Study on plant regeneration in diverse cultivars ofMedicagosativa.Acta Prataculturae Sinica,2004,13(6):99-105.(in Chinese)

[22] 陳智勇，易自力，蔣建雄，覃靜萍，劉清波，蔡能，唐小艷，孫鏖．多年生黑麥草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立．草原與草坪，2007(3)：28-32． Chen Z Y,Yi Z L,Jiang J X,Qin J P,Liu Q B,Cai N,Tang X Y,Sun A.Establishment of the transformation receptor system forLoliumperenne.Grassland and Turf,2007(3):28-32.(in Chinese)

[23] 陽宴清，王詠，朱美蘭，盧運海．蘆竹愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系的建立．草業(yè)科學(xué)，2016，33(7)：1332-1341． Yang Y Q,Wang Y,Zhu M L,Lu Y H.A study on callus induction and plant regeneration in giant reed.Pratacultural Science,2016,33(7):1332-1341.(in Chinese)

[24] Bahgat S,Shabban O A,El-Shihy O,Lightfoot D A,El-Shemy H A.Establishment of the regeneration system forViciafabaL.Current Issues in Molecular Biology,2009,11(1):47-54.

[25] 鄭若男，阮以勒，鄭雙雙，楊志紅．原種黑麥草組培再生體系建立初探．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(15)：6608-6610． Zheng R N,Ruan Y L,Zheng S S,Yang Z H.Establishment of tissue regeneration system ofLoliummultiflorumL.Anhui Agricultural Sciences,2013,41(15):6608-6610.(in Chinese)

(責(zé)任編輯 王芳)

Optimisation and establishment of a high frequency regeneration system forLoliummultiflorum‘Tetragold’ andL.perenne‘Four seasons’

Zeng Qing-fei, Wei Xin, Chen Xi, Chen Guang-jie, Ma Pei-jie, Wu Jia-hai, Wang Xiao-li

(Guizhou Institute of Prataculture, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China)

Using mature seeds of the major ryegrass cultivars in Guizhou Province, annual ryegrass Tetragold and perennial ryegrass Four seasons, as explants, experiments on callus induction and plantlet regeneration were carried out. The results indicated that by peeling off the glume of mature seeds, resecting one-third of the endosperm end, and putting the treated explants of annual ryegrass Tetragold on a medium of CC+7 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA and those of perennial ryegrass Four seasons on a medium of CC+5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA, the contamination rates of the tissue cultures were significantly decreased, and the highest callus induction rates occurred (65.52% for annual ryegrass Tetragold and 63.55% for perennial ryegrass Four seasons). Transferring the callus induced in the two cultivars on a subculture medium of MS+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA+1.25 mg·L-1CuSO4+1.0 g·L-1CH promoted the formation of type Ⅱ embryogenic callus with better quality. The plant expression vector pCAMBIA 1300 would be used in the subsequent experiment on transformation, and hygromycin was chosen as the best antibiotic selective agent (appropriate critical concentration 30 to 40 mg·L-1). On a medium of MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1TDZ, the highest differentiation rate was 86.37% for embryogenic callus of annual ryegrass Tetragold, and on a medium of MS+6.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+5.0 mg·L-1KT, the embryogenic callus of perennial ryegrass Four seasons produced the highest differentiation rate of 85.40%. On a rooting culture medium of 1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IAA, the adventitious buds of both the cultivars attained a rooting rate of 100%; thus, a large number of plantlets were produced by tissue culture. The nutrition soil which was composed of the same proportion of humus, vermiculite, and sandy loam ensured a survival rate of more than 99%. In the present study, the high frequency regeneration systems for annual ryegrass Tetragold and perennial ryegrass Four seasons were optimised and established, which would lay a reliable foundation for their genetic transformation.

Loliummultiflorum‘Tetragold’;L.perenne‘Four seasons’; explant treatment; medium components; combinations of hormone concentration; antibiotic selective agent; tissue culture regeneration system

Wang Xiao-li E-mail:wangxiaolizhenyuan@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0531

2016-10-17 接受日期：2017-03-06

貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(黔科合NY[2013]3060號)；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動基金(2013-06)；黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項字(2014)010號；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊建設(shè)項目(黔科合平臺人才[2016]5617)

曾慶飛(1969-)，男(土家族)，貴州德江人，副研究員，博士，主要從事牧草生物技術(shù)研究。E-mail:zengqingfei2008@163.com

王小利(1977-)，男，甘肅鎮(zhèn)原人，研究員，博士，主要從事牧草分子生物學(xué)研究。E-mail:wangxiaolizhenyuan@126.com

S543+.6;S503.2

A

1001-0629(2017)08-1649-12

曾慶飛，韋鑫，陳錫，陳光潔，馬培杰，吳佳海，王小利.多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季高頻組培再生體系的優(yōu)化與建立.草業(yè)科學(xué),2017,34(8)：1649-1660.

Zeng Q F,W X,Chen X,Chen G J,Ma P J,Wu J H,Wang X L.Optimisation and establishment of a high frequency regeneration system forLoliummultiflorum‘Tetragold’ andL.perenne‘Four seasons’.Pratacultural Science，2017,34(8)：1649-1660.