狄海萍 李曉亮 薛繼東 李強(qiáng) 曹大勇 韓大偉 夏成德(鄭州市第一人民醫(yī)院 燒傷中心 河南 鄭州 450000)

表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)糖尿病難愈創(chuàng)面的可行性分析

狄海萍 李曉亮 薛繼東 李強(qiáng) 曹大勇 韓大偉 夏成德
(鄭州市第一人民醫(yī)院 燒傷中心 河南 鄭州 450000)

目的 對(duì)表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)糖尿病難愈創(chuàng)面的可行性進(jìn)行分析和探討。方法 選取60只體質(zhì)量250～300 g的雄性SD大鼠，建立糖尿病SD大鼠創(chuàng)面模型，分離培養(yǎng)大鼠皮膚表皮干細(xì)胞(ESCs)，使用5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。使用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為A、B、C組，A組大鼠皮膚創(chuàng)面接受羊膜負(fù)載BrdU標(biāo)記的ESCs組織工程皮膚移植；B組大鼠皮膚創(chuàng)面接受羊膜移植；C組大鼠皮膚創(chuàng)面不接受處理。觀察3組大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合情況。結(jié)果 A組大鼠治療7、14 d后的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度平均值以及創(chuàng)面愈合率均高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)糖尿病難愈創(chuàng)面安全可行。

表皮干細(xì)胞；羊膜；糖尿??；難愈創(chuàng)面

現(xiàn)今我國(guó)糖尿病患者發(fā)病人數(shù)逐年遞增，預(yù)計(jì)2025年糖尿病患者人數(shù)將達(dá)6 000萬(wàn)。因血管和神經(jīng)發(fā)生病變，糖尿病患者極易出現(xiàn)潰瘍，不斷擴(kuò)大，且糖尿病患者后期生活中可能會(huì)遭遇不同程度的事故而需要接受手術(shù)治療，以上因素均會(huì)造成程度不同的“難愈創(chuàng)面”。糖尿病創(chuàng)面難愈為目前常見(jiàn)的臨床難題，本研究以60只雄性SD大鼠為對(duì)象，分析探討表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)糖尿病難愈創(chuàng)面的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取60只體質(zhì)量250～300 g的雄性SD大鼠作為本次研究對(duì)象，大鼠是由南昌大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有對(duì)大鼠進(jìn)行的操作與處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。研究所用材料如下：美國(guó)K19抗體；Sigma Ⅳ型膠原；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)；5-BrdU(Adooq Bioscience)；β1整合素(英國(guó)abcam)；BrdU抗體(中國(guó)北京中杉金橋公司)；胰蛋白酶-EDTA(美國(guó)Gibco公司)；角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、胎牛血清。

1.2 方法 隨機(jī)抽取40只大鼠建立糖尿病模型，剩下20只行表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)。糖尿病模型建立方法如下：禁食16 h以上，對(duì)禁食完畢的大鼠體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量[1]；抽取大鼠尾部空腹靜脈血，測(cè)定血糖濃度；將0.1 mol的pH 4.5檸檬酸鈉緩沖液加入STZ與檸檬酸的混合液中，搖勻配制成注射液；過(guò)濾除菌處理后對(duì)大鼠進(jìn)行一次性腹腔注射，65 mg/kg；注射72 h后，使用穩(wěn)步血糖測(cè)定儀對(duì)大鼠隨機(jī)體質(zhì)量、血糖、毛發(fā)顏色變化等進(jìn)行檢測(cè)；每周測(cè)量1次大鼠血糖，若大鼠在連續(xù)3次的血糖檢測(cè)中，血糖值均≥16.7 mmol/L，同時(shí)臨床表現(xiàn)出消瘦、多飲、多食、多尿的“一少三多”癥狀，則認(rèn)為該大鼠為DM大鼠[2]。

表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法：無(wú)菌條件下剝離大鼠全層背部皮膚；刀片徹底清除皮膚結(jié)締組織與皮下組織，漂洗；將皮片剪成面積為0.3 cm×0.5 cm的大小，置入培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.02%濃度的EDTA以及0.25%濃度的胰蛋白酶，體積比為5∶1；4 ℃冰箱中保存、消化過(guò)夜；磷酸鹽緩沖液稀釋Ⅳ型膠原，并將稀釋后的液體培養(yǎng)板上均勻涂抹，風(fēng)干備用；取出皮條片并將適量的胎牛血清滴于其上[3]；200目篩網(wǎng)過(guò)濾表皮層，1 000 r/min的速度離心5 min，分離血清，制成細(xì)胞懸液；培養(yǎng)20 min后取出，加入10%的胎牛血清以及10 μg/L的表皮生長(zhǎng)因子，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞70%～80%融合后，以1∶3的比例傳代；細(xì)胞β1整合素以及K19接受免疫細(xì)胞化學(xué)法的檢測(cè)，若均呈現(xiàn)陽(yáng)性，則鑒定為ESCs[4]。皮膚創(chuàng)面的修復(fù)：A組大鼠行經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增、羊膜負(fù)載、ESCs組織工程皮膚移植的修復(fù)；B組大鼠行羊膜修復(fù)；C組大鼠創(chuàng)面不接受任何干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察大鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況，計(jì)算大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合面積，皮膚愈合面積百分率=(皮膚創(chuàng)面初始面積-治療后皮膚愈合面積)/皮膚創(chuàng)面初始面積×100%。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片等，大鼠陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度的平均值采用Image-proplus 6.0軟件測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 皮膚創(chuàng)面愈合情況 治療7、14 d后，A組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率均明顯高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠治療7、14 d后皮膚創(chuàng)面愈合情況比較

注：與B、C組比較，aP<0.05。

2.2 PCNA陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度平均值 A組大鼠治療7、14 d后的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度平均值與B、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠治療7、14 d后PCNA陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度平均值比較

注：與B、C組比較，bP<0.05。

3 討論

羊膜位于胎盤最內(nèi)層，為具有一定彈性的半透明薄膜，結(jié)構(gòu)與人眼結(jié)膜組織相似，其內(nèi)包含多種能夠促進(jìn)結(jié)膜細(xì)胞增殖、角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，早在100多年前便作為一種敷料廣泛應(yīng)用于外科的臨床治療中。多項(xiàng)研究證明羊膜為構(gòu)建皮膚理想的組織工程支架材料，一方面能加速負(fù)載細(xì)胞的生長(zhǎng)，有效控制炎癥，促進(jìn)潰瘍愈合；一方面能誘導(dǎo)纖維血管組織長(zhǎng)入，并可在機(jī)體新生皮膚生長(zhǎng)成熟后自動(dòng)降解，對(duì)人體幾乎無(wú)不良影響[5]。

羊膜為半透明的薄膜，含有多種促進(jìn)細(xì)胞增殖的營(yíng)養(yǎng)成分，可為細(xì)胞的分化、增殖提供豐富營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。表皮干細(xì)胞作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞，有強(qiáng)大的增殖及多向分化的潛能，是皮膚組織發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)及改建的關(guān)鍵性細(xì)胞。在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，創(chuàng)面的再上皮化依賴表皮細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為的正常發(fā)揮，從創(chuàng)面愈合過(guò)程中表皮干細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化來(lái)看，表皮干細(xì)胞數(shù)量少和活性低是導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的重要原因。本研究中，接受因表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)的A組治療7、14 d后的創(chuàng)面愈合率均顯著高于接受羊膜移植的B組以及未接受任何處理的C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，A組大鼠治療7、14 d后PCNA陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度平均值亦明顯高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)是提高糖尿病難愈創(chuàng)面治療效果的有效途徑，ESCs能夠主動(dòng)參與到糖尿病的創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，有效發(fā)揮促上皮化作用，加速創(chuàng)面好轉(zhuǎn)。

綜上所述，表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)糖尿病難愈創(chuàng)面效果顯著，安全可靠，具有高度可行性，值得臨床進(jìn)一步推廣和使用。

[1] 劉德伍,鐘清玲,劉繁榮,等.表皮干細(xì)胞復(fù)合羊膜構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)糖尿病難愈創(chuàng)面[J].透析與人工器官,2010,21(3):12-14,46.

[2] 劉愛(ài)軍,黃錦桃,李海標(biāo),等.ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞與類真皮構(gòu)建組織工程皮膚的體內(nèi)分化[J].解剖學(xué)研究,2006,28(3):161-164,封二.

[3] 黃文琪,可金星,陶忠芬,等.掃描電鏡在人羊膜負(fù)載豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].電子顯微學(xué)報(bào),2004,23(4):319.

[4] 聶剛,亓俊華,姜南雁,等.高濃度葡萄糖對(duì)小鼠表皮干細(xì)胞增殖的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2014,43(10):99-103.

[5] 陸樹(shù)良,謝挺,牛軼雯,等.糖尿病合并創(chuàng)面難愈的機(jī)制研究[J].藥品評(píng)價(jià),2011,8(7):17-21.

Feasibility analysis of tissue engineering skin constructed by epidermal stem cells and amniotic membrane for the repair of diabetic refractory wound

Di Haiping, Li Xiaoliang, Xue Jidong, Li Qiang, Cao Dayong, Han Dawei, Xia Chengde
(BurnCenter,theFirstPeople’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China)

Objective To analyze the feasibility of tissue engineering skin constructed by epidermal stem cells and amniotic membrane for the repair of diabetic refractory wound. Methods A total of 60 male SD rats with body mass of 250 to 300 g were selected and established diabetic wound model. Rat skin epidermal stem cells (ESCs) were isolated and cultured, and labelled by 5- bromodeoxyuridine (5-BrdU). All the rats were divided into group A, B and C according to a random number table method. Group A

the transplantation of amniotic membrane-loaded and BrdU-labeled ESCs tissue engineering skin, Group B received amniotic membrane transplantation, and Group C did not accept the deal. The wound healing of 3 groups of rats was observed. Results The PCNA positive cells, integral optical density, mean value and wound healing rate of group A were higher than those in group B and C 7 and 14 d after treatment, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion Tissue engineering skin constructed by epidermal stem cells and amniotic membrane is feasible for the repair of diabetic refractory wound.

epidermal stem cell; amniotic membrane; diabetes; refractory wound

夏成德，E-mail：xcdeyxyj@126.com。

R 641

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.16.009

2016-11-25)