張永麗　王朔　郝麥玲

【摘要】 目的 探討柿葉黃酮對大鼠口腔潰瘍的治療作用及其抗炎機(jī)制。方法 60只SD大鼠， 分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組及柿葉黃酮20、40、80 mg/kg組， 每組10只?？瞻讓φ战M不做處理， 其他各組建立口腔潰瘍大鼠模型（醋酸法）， 空白對照組、模型對照組給予灌胃等體積生理鹽水， 陽性對照組給予灌胃西瓜霜， 柿葉黃酮組給予灌胃相應(yīng)劑量柿葉黃酮。比較造模后第4、7天的潰瘍面積， 測定潰瘍組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結(jié)果 用藥后4、7 d， 陽性對照組、柿葉黃酮40 mg/kg

組、柿葉黃酮80 mg/kg組大鼠的潰瘍面積均小于模型對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05）。模型對照組（66.5±4.1）ng/L、陽性對照組（38.7±4.7）ng/L、柿葉黃酮組[（40.2±3.8）、（35.8±4.6）、（32.6±3.8）ng/L]大鼠潰瘍組織內(nèi)TNF-α水平高于空白對照組（27.8±3.2）ng/L， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05）。陽性對照組、柿葉黃酮組大鼠潰瘍組織內(nèi)TNF-α水平低于模型對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05）。結(jié)論 柿葉黃酮對醋酸誘導(dǎo)的口腔潰瘍有一定的治療作用， 其機(jī)制可能與降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 柿葉黃酮；口腔潰瘍；氧化應(yīng)激；炎癥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.103

【Abstract】 Objective To investigate the therapeutic effect of persimmon leaf flavonoid on oral ulcer in rats and its anti - inflammatory mechanism. Methods A total of 60 SD rats were divided into blank control group， model control group and positive control group， persimmon leaf flavonoid 20， 40 and 80 mg/kg group， with 10 rats in each group. The blank control group received no treatment， and the other groups established the models of rat oral ulcer （acetic acid）. Blank control group， model control group was treated with intragastric administration of equal volume normal saline， the positive control group was treated with intragastric administration of watermelon frost， and persimmon leaf flavonoid group was treated with intragastric administration of corresponding dose persimmon leaf flavonoid. The ulcer area was compared after 4 and 7 days of modeling， and the level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in ulcer tissue was measured. Results After 4 and 7 d of medication， the positive control group， persimmon leaf flavonoid 40 and 80 mg/kg group had smaller ulcer area than model control group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. The model group （66.5±4.1） ng/L， positive control group （38.7±4.7） ng/L and persimmon leaf flavonoid group [（40.2±3.8）， （35.8±4.6） and （32.6±3.8） ng/L] had higher TNF-α level in ulcer tissue than bland control group （27.8±3.2）ng/L， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The positive control group and persimmon leaf flavonoid group had lower TNF-α level in ulcer tissue than model control group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion Persimmon leaf flavonoid have a certain therapeutic effect on acetic acid-induced oral ulcers， and its mechanism may be related to the reduction of inflammatory response.

【Key words】 Persimmon leaf flavonoid； Oral ulcer； Oxidative stress； Inflammationendprint

口腔潰瘍（oral ulcer）是口腔黏膜病中最常見的疾病， 以復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer， ROU）為主， 一般人群中的發(fā)病率可達(dá)20%[1]。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的臨床特征有：致痛性、自限性和反復(fù)發(fā)作等。患者常由于疼痛而導(dǎo)致咀嚼、飲水、吞咽以及說話困難， 嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[2]。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的病因目前尚不明確， 由于復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病因和病機(jī)的復(fù)雜性， 導(dǎo)致臨床上缺乏特效治療藥物[3]。在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的病因和病機(jī)中， 炎癥反應(yīng)對疾病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要作用[4]。柿葉黃酮（persimmon leaf flavonoid， PLF）是柿葉中的主要有效成分。據(jù)明代《滇南本草》記載“經(jīng)霜葉敷臁瘡”， 臁瘡即為小腿的一種慢性潰瘍， 由此提示外用柿葉可用于治療潰瘍?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， 柿葉黃酮具有抗氧化、抗炎等多種藥理作用[5]?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)， 作者通過建立口腔潰瘍模型， 進(jìn)行柿葉黃酮的藥物干預(yù)， 觀察柿葉黃酮的療效并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 SPF級健康SD大鼠60只， 體重200～240 g， 雌雄各半， 購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司， 合格證號為SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)1周， 以適應(yīng)新環(huán)境。12 h晝夜交替， 室溫20～25℃， 濕度為40%～60%， 普通飼料喂養(yǎng)， 自由飲水。

1. 2 試劑和藥品 柿葉黃酮由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司提供；桂林西瓜霜（桂林三金藥業(yè)股份有限公司 ， 國藥準(zhǔn)字Z45021599）；TNF-α Elisa試劑盒（上海朗頓生物技術(shù)有限公司， 20161122TG）。

1. 3 主要儀器 小動物麻醉機(jī)（瑞沃德生命科技有限公司）；Infinite? 200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；低溫高速離心機(jī)（德國eppendorf公司）；游標(biāo)卡尺（上海首豐精密儀器有限公司）。

1. 4 方法

1. 4. 1 大鼠口腔潰瘍模型的制備 參考文獻(xiàn)[6]方法：以戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠， 將50%冰醋酸濾紙片（3 mm×3 mm）置于下切牙唇側(cè)穹窿區(qū)30 s， 移除濾紙片后觀察受損區(qū)變化?？瞻讓φ战M不做處理。模型大鼠在冰醋酸處理后24 h均出現(xiàn)明顯潰瘍面， 肉眼觀察潰瘍面的黏膜呈凹陷性損傷， 表面為蒼白色， 周圍充血水腫明顯， 口腔潰瘍模型制備成功。

1. 4. 2 實驗分組和給藥 SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組及柿葉黃酮20、40、80 mg/kg組， 每組10只。陽性對照組給予灌胃西瓜霜200 mg/kg， 柿葉黃酮各組給予相應(yīng)劑量的柿葉黃酮， 空白對照組、模型對照組給予灌胃等體積的生理鹽水。于造模后第2天給藥， 連續(xù)給藥7 d。

1. 5 觀察指標(biāo)

1. 5. 1 潰瘍面積的測定[7] 用游標(biāo)卡尺測量各組模型大鼠給藥前及給藥后第4、7天口腔潰瘍的最大橫徑（d1）及最大縱徑（d2）， 計算潰瘍面積（潰瘍面積=π×d1×d2×1/4， π取值3.14）。

1. 5. 2 樣品處理 末次給藥1 h后， 戊巴比妥鈉麻醉， 先腹主動脈取血， 后取潰瘍面組織。每組留取7只大鼠的正?；驖兘M織加入9倍量的冷生理鹽水進(jìn)行勻漿處理， 4℃、3000 r/min離心10 min， 分離上清液， -20℃保存。

1. 5. 3 TNF-α的測定 按試劑盒說明書操作， 測定組織中TNF-α的水平。

1. 6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用單因素方差分析（One way AVONA）。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 柿葉黃酮對大鼠口腔潰瘍面積的影響 用藥前， 模型對照組、陽性對照組、柿葉黃酮組大鼠的潰瘍面積比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。用藥后4、7 d， 陽性對照組、柿葉黃酮40 mg/kg組、柿葉黃酮80 mg/kg組大鼠的潰瘍面積均小于模型對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05）。見表1。

2. 2 柿葉黃酮對口腔潰瘍大鼠潰瘍組織中TNF-α的影響

模型對照組（66.5±4.1）ng/L、陽性對照組（38.7±4.7）ng/L、柿葉黃酮組[（40.2±3.8）、（35.8±4.6）、（32.6±3.8）ng/L]大鼠潰瘍組織內(nèi)TNF-α水平高于空白對照組（27.8±3.2）ng/L， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05） 。陽性對照組、柿葉黃酮組大鼠潰瘍組織內(nèi)TNF-α水平低于模型對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是人群中最為常見的口腔黏膜疾病， 疼痛和反復(fù)發(fā)作給患者帶來諸多不便。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病原因目前尚不清楚， 已知與眾多因素如內(nèi)分泌紊亂、免疫功能失調(diào)、創(chuàng)傷、吸煙、應(yīng)激、非甾體類抗炎藥物的應(yīng)用、維生素或微量元素的缺乏、遺傳因素等有關(guān)[1]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)， 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍屬于一種慢性炎癥性疾病[8]。TNF-α是一種關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子， 可通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的粘附功能和誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化等作用啟動炎癥反應(yīng)。目前已經(jīng)開發(fā)出抗TNF-α的藥物， 可以改善難治性復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的癥狀[9， 10]。本次研究發(fā)現(xiàn)， 柿葉黃酮20、40、80 mg/kg可顯著的降低潰瘍組織內(nèi)的TNF-α水平。

近年來針對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病因的復(fù)雜性， 基于天然植物藥效成分的多靶點和多向性， 人們開始從天然產(chǎn)物中尋求治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的新藥[11]。已知柿葉黃酮是一種良好的天然抗氧化劑， 除了抗氧化作用外還有抗炎、止血、抗菌等作用[5]。柿葉黃酮的這些藥理學(xué)作用可針對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍復(fù)雜的病因發(fā)揮多向性的治療效果。本研究初步證實柿葉黃酮可用于口腔潰瘍的治療， 其機(jī)制可能與抗炎作用有關(guān)。對于柿葉黃酮防治口腔潰瘍的其他機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。endprint

參考文獻(xiàn)

[1] Natah SS， Konttinen YT， Enattah NS， et al. Recurrent aphthous ulcers today： a review of the growing knowledge. International Journal of Oral & Maxillofacial Surgery， 2004， 33（3）：221.

[2] Yang Y， Zhang T， Dong Z， et al. Short-Term Efficacy of Pudilan Keyanning Toothpaste in Treatment of Minor Recurrent Aphthous Ulcers. Evid Based Complement Alternat Med， 2016：9125327.

[3] Williams LA， Bramwell BL. Current concepts in the treatment of recurrent aphthous ulcers. Int J Pharm Compd， 2011， 15（1）：13-18.

[4] Avci E， Akarslan ZZ， Erten H， et al. Oxidative stress and cellular immunity in patients with recurrent aphthous ulcers. Braz J Med Biol Res， 2014， 47（5）：355-360.

[5] Xie C， Xie Z， Xu X， et al. Persimmon （Diospyros kaki L.） leaves： a review on traditional uses， phytochemistry and pharmacological properties. Journal of Ethnopharmacology， 2015（163）：229-240.

[6] Hitomi S， Ono K， Yamaguchi K， et al. The traditional Japanese medicine hangeshashinto alleviates oral ulcer-induced pain in a rat model. Archives of Oral Biology， 2016（66）：30-37.

[7] 陳卓，王金磊，莊朋偉，等.清咽滴丸治療大鼠口腔潰瘍的實驗研究. 中草藥， 2016， 47（1）：106-108.

[8] Alsamadi A， Drozd A， Salem A， et al. Epithelial Cell Apoptosis in Recurrent Aphthous Ulcers. Journal of Dental Research， 2015， 94（7）：928.

[9] ?lebioda Z， Szponar E， Kowalska A. Etiopathogenesis of Recurrent Aphthous Stomatitis and the Role of Immunologic Aspects： Literature Review. Archivum Immunologiae Et Therapiae Experimentalis， 2014， 62（3）：205-215.

[10] ONeill ID. Efficacy of tumour necrosis factor-α antagonists in aphthous ulceration： review of published individual patient data. Journal of the European Academy of Dermatology & Venereology， 2012， 26（2）：231-235.

[11] Ryu HJ， Seo MR， Choi HJ， et al. Infliximab for refractory oral ulcers. American Journal of Otolaryngology， 2014， 35（5）：664-668.

[收稿日期：2017-04-20]endprint