楊 勇，姚天月，龔興旺

（黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 興義 562400）

HPLC-DAD法測定牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留的研究

楊 勇，姚天月，龔興旺

（黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 興義 562400）

目的 建立高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器（HPLC-DAD）測定牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留量的方法。方法 樣品以5%乙酸乙腈提取，經(jīng)改進(jìn)的分散固相萃取樣品前處理凈化技術(shù)凈化，使其溶液澄清，便于進(jìn)樣和保護(hù)色譜柱。結(jié)果 6種氟喹諾酮類藥物成分均達(dá)到基線分離，具有良好的線性關(guān)系（R=0.999 9），重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度較好（RSD均＜2%），低、中和高3個濃度的回收率均＞98%（RSD均＜1%）。結(jié)論 本法專屬性強(qiáng)，操作簡單，靈敏度高，適用于牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留檢測。

高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器；牛奶；氟喹諾酮類藥物；藥物殘留

氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）是喹諾酮類藥物經(jīng)加氟結(jié)構(gòu)改造后的衍生物，也是近十多年來研究最多、發(fā)展最快的一類合成抗菌藥。該類藥物具有吸收好，組織濃度高，半衰期長，抗菌譜廣，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[1]。FQs藥物由于藥物本身特性和濫用，容易使受體產(chǎn)生諸多不適，如：皮膚過敏及光敏反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)反應(yīng)、消化系統(tǒng)反應(yīng)、泌尿系統(tǒng)反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)反應(yīng)、軟骨毒性、肝臟毒性、生殖毒性、跟腱炎和局部刺激癥狀等[2]，對動物及人類健康造成一定危害。隨著FQs藥物在獸醫(yī)臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其殘留問題引起廣泛關(guān)注。為了監(jiān)控FQs藥物在動物性食品中的殘留情況，聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、食品添加劑聯(lián)合專家委員會以及歐盟等均對氟喹諾酮類藥物殘留量做出了相應(yīng)規(guī)定[3，4]。目前用于FQs藥物殘留的檢測方法主要有微生物法、高效液相色譜法、高效薄層色譜法、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法、高效毛細(xì)管電泳法、高效免疫親和色譜法、免疫分析法等[5～12]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)《牛奶中喹諾酮類藥物殘留的測定（GB 29692-2013）》采用液相色譜—熒光檢測器檢測法和液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行氟喹諾酮類藥物殘留測定，國家標(biāo)準(zhǔn)《蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留的檢測（GB/T 23412-2009）》采用液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行氟喹諾酮類藥物殘留測定。但是，受設(shè)備條件及實驗成本限制，這些方法很難在國內(nèi)普及，故探索更為經(jīng)濟(jì)實用的氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法迫在眉睫。

本文以近年來在獸藥殘留檢測中應(yīng)用日趨廣泛的分散固相萃取樣品前處理凈化技術(shù)（QuEChERS）以及高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器（HPLC-DAD）對牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留量進(jìn)行檢測。經(jīng)驗證，該方法簡單、快速、靈敏度高，各項技術(shù)指標(biāo)均能滿足牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留檢測要求，具有較強(qiáng)的實用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國戴安公司，配四元梯度泵，120位自動進(jìn)樣器，Chromeleon色譜工作站，紫外檢測器）；TD6M醫(yī)用離心機(jī)（長沙平凡儀器有限公司）；BT2202S電子分析天平（德國Sanorius公司）；TALBOYS渦旋儀（美國亨利特里姆有限公司）；KQ-500AD型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（南昌市恒順化驗設(shè)備制備有限公司）；0.45μm微孔濾膜。

1.2 試藥

15批牛奶樣品均為市售。6種氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星（純度為 98.50%C 13170000 lot：91111德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），沙拉沙星（純度為95.50%C 16908000 lot：10407德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），雙氟沙星（純度為97.50%C 12627000 lot：91103德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），諾氟沙星（純度為99.50%C 15648000 lot：10214德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），環(huán)丙沙星（純度為95.00%C 11668500 lot：00526德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），丹諾沙星（純度為94.00%C 11960500 lot：00920德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）。乙腈、甲醇（色譜純，美國天地試劑公司）；冰醋酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三乙胺（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；N-正丙基乙二胺（PSA）（美國SELECTRA公司）；正己烷（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鎂（分析純，天津市美琳工貿(mào)有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備 精密稱取對照品，恩諾沙星0.010 11 g、沙拉沙星0.010 27 g、雙氟沙星0.010 22 g、諾氟沙星0.010 89 g、環(huán)丙沙星0.010 70 g、丹諾沙星0.010 81 g，分別置10ml容量瓶中，加入20μl甲酸和適量甲醇溶解，最后用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液1.00m l分置100m l量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為9.958 3μg/m l，9.907 8μg/m l，9.964 5μg/ml，10.835 6μg/m l，10.165 0μg/m l，10.161 4μg/m l的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的制備 精密吸取恩諾沙星、雙氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.00m l，沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5.00m l，丹諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.20m l置同一100 ml量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得相應(yīng)濃度分別為恩諾沙星0.099 6μg/m l，沙拉沙星0.490 4μg/m l，雙氟沙星0.099 6μg/m l，諾氟沙星0.108 4μg/m l，環(huán)丙沙星0.101 7 μl/ml，丹諾沙星0.020 3μg/m l的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（使用前現(xiàn)配）。

2.2 供試品溶液的制備

稱取牛奶樣品10.0 g于50 ml離心管中，加入5%乙酸乙腈溶液15m l，渦旋1min；加入無水硫酸鈉1.5 g和無水硫酸鎂6.0 g，渦旋5min，離心（4 000 r/min）5min，取上清液于另一50 ml離心管中，加入正己烷5m l，渦旋1min，取下層溶液；上述殘渣再加入5%乙酸乙腈溶液10 ml，渦旋1 min，離心（4 000 r/min）5min，取上清液經(jīng)同一份正己烷萃取，合并下層溶液，置50℃水浴鍋上蒸干。上述殘渣加0.2%甲酸水溶液2m l，轉(zhuǎn)移入另一10m l離心管中，加入PSA凈化劑0.2 g和無水硫酸鎂0.5 g，渦旋1min，離心（4 000 r/min）5 min，上清液過0.45μm微孔濾膜，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）；檢測波長：279 nm；柱溫30℃；流動相以乙腈為A相，以含0.1%甲酸的20mmol/L甲酸銨水溶液為B相，等度洗脫（A∶B=12∶88）；流速1.0 m l/min；DAD檢測器；進(jìn)樣量：10μl；根據(jù)保留時間定性，峰面積定量。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別取混合對照品溶液、陰性供試品溶液和自制模擬樣品溶液注入液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。從圖中可見，陰性供試品溶液在諾氟沙星、環(huán)丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和雙氟沙星位置處無干擾峰，自制模擬樣品溶液中各目標(biāo)組分均達(dá)到基線分離（分離度＞1.5），理論塔板數(shù)按諾氟沙星峰計算不低于60 000，結(jié)果見圖1～3。

2.5 線性方程的考察

按“2.1.2”項下方法配制一定濃度范圍的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積值，以各組分進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制線性關(guān)系圖，得回歸方程。由表1可見，該方法中6種喹諾酮類藥物在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），結(jié)果見表1。

圖1 6種氟喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 模擬陽性樣品色譜圖

圖3 陰性樣品色譜圖

表1 6種氟喹諾酮類藥物的線性方程

2.6 精密度試驗

取同一批樣品（自制模擬樣品），按照“2.2”項下供試品制備方法和“2.3”項下色譜條件，對該樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積值，分別測定上述6種氟喹諾酮類藥物的含量，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。結(jié)果顯示，6種氟喹諾酮類藥物的RSD值分別為0.93%、1.23%、1.73%、1.97%、1.62%、1.75%，均＜2%，說明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（自制模擬樣品），精密稱取，平行6份，按上述方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測定6種氟喹諾酮類藥物的含量，計算RSD值。結(jié)果顯示，6種氟喹諾酮類藥物的RSD值分別為1.12%、1.26%、1.20%、1.28%、1.07%、1.02%，均＜2%，說明本法重復(fù)性好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取樣品（自制模擬樣品），按上述方法制成供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測定6種氟喹諾酮類藥物的含量，計算RSD值。結(jié)果顯示，6種氟喹諾酮類藥物的RSD值分別為0.84%、0.91%、0.47%、0.83%、0.40%、0.33%，均＜2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.9 檢出限與定量限

取樣品（自制模擬樣品），按上述方法制成供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，以信噪比法（S/N=3）考察6種氟喹諾酮類藥物的最低檢出限；以信噪比法（S/N=10）考察6種氟喹諾酮類藥物的定量限，結(jié)果見表2。

表2 6種氟喹諾酮類藥物的檢出限及定量限（μg/kg）

2.10 回收率試驗

精確稱取陰性供試品10.00 g，按“2.1.2”項下制備方法配制相應(yīng)濃度的混合對照品溶液，分別加入0.03μg/ml、0.05μg/m l、0.10μg/m l濃度的氟喹諾酮類藥物對照品溶液1m l。按“2.2”項下制備樣品溶液和“2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，每個濃度平行制備3份樣品，計算回收率及RSD值。結(jié)果表明，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星的平均回收率分別為99.52%、98.70%、99.23%、98.67%、99.24%、99.39%，RSD值分別為0.13%、0.39%、0.56%、0.69%、0.30%、0.75%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)對藥物殘留檢測的要求。

2.11 樣品測定結(jié)果

取牛奶樣品15批，按“2.2”項下樣品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定。根據(jù)樣品與對照品溶液的保留時間定性、峰面積定量，判斷各樣品中氟喹諾酮類藥物的種類及含量。結(jié)果顯示，15批樣品中均未檢出這6種氟喹諾酮類藥物。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

目前，對于氟喹諾酮類藥物的提取較為成熟的方法是用乙腈提取，考慮到氟喹諾酮易溶于酸堿故選擇酸或堿性乙腈為提取溶劑。由于牛奶基質(zhì)的特殊性，實驗過程中發(fā)現(xiàn)直接加入乙腈提取，牛奶會變成乳濁液，因此，提取時加入沉淀蛋白，使之形成均相體系，故選擇酸性乙腈作為提取溶劑。本研究同時也對提取溶劑的酸度、提取方法、提取次數(shù)、提取時間等因素進(jìn)行了考察，結(jié)果證明，樣品經(jīng)過5%乙酸乙腈渦旋，振蕩，提?。▋纱危看翁崛r間為10mm得出的結(jié)果最為理想。

3.2 流動相的考察

目前，有關(guān)液相色譜法測定氟喹諾酮含量的研究中大部分選用的流動相為磷酸/三乙胺、磷酸鹽/四丁基溴化銨、磷酸/庚烷磺酸鈉體系，實驗條件比較苛刻。由于流動相含鹽不易沖洗，易造成色譜柱和檢測器堵塞，且能滿足條件的色譜柱使用壽命也較短，所以不可取。本研究對比了0.05mol/L磷酸水溶液—三乙胺調(diào)pH 2.5、3.0、3.5的0.2%甲酸水溶液和0.1%甲酸的20 mmol/L甲酸銨水溶液，發(fā)現(xiàn)選用0.1%甲酸的20mmol/L甲酸銨水溶液作為流動相，6種目標(biāo)氟喹諾酮類藥物能得到很好的分離，理論塔板數(shù)、對稱因子、拖尾因子均滿足要求，且實驗條件較溫和不會對色譜柱造成損傷。此外，我們還對流動相酸度以及洗脫方式進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2%甲酸酸度、等度洗脫得出的結(jié)果較為理想。

3.3 凈化劑的選擇

目前，對于喹諾酮類藥物的凈化大多選擇固相萃取。但是，此方法操作步驟繁瑣、費用較高且回收率普遍偏低。本研究對近年來在農(nóng)獸藥殘留檢驗中應(yīng)用廣泛的QuEChERS（Quickly，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）進(jìn)行了探索。分散固相萃取技術(shù)常用的吸附劑有C18、NH2、PSA、PAX 4種，根據(jù)牛奶基質(zhì)特點，本研究選取C18柱、HLB柱、SPE柱和PSA比較凈化效果及其對目標(biāo)物回收率的影響。實驗證明，HLB柱會使目標(biāo)物有很大損失，然而SPE柱、C18柱和PSA吸附劑對于回收率的影響沒有明顯區(qū)別，但C18柱和SPE柱對牛奶中蛋白質(zhì)類提取物凈化效果有限，故采用PSA作為吸附劑。本研究同時考察了凈化劑用量，實驗證明，PSA吸附劑用量為200 mg時就能起到很好的凈化效果。

3.4 耐用性的考察

本研究考察了不同柱溫、不同色譜柱、不同流速對實驗結(jié)果的影響，結(jié)果證明所選柱溫、流速均能達(dá)到理想效果，通過對不同色譜柱的考察發(fā)現(xiàn)，以UltimateXB-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）作為色譜柱能達(dá)到有效分離，且峰形較好。

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R155.5+7

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：1671-1246（2017）17-0097-03