楊京利， 張 力， 向 勇， 馬國平

1復旦大學附屬浦東醫(yī)院麻醉科，上海 201399 2湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院疼痛科，十堰 442000 3上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院麻醉科，上海 201318

海馬區(qū)血小板活化因子合酶及其受體的表達對選擇性神經損傷大鼠痛覺敏化的影響*

楊京利1， 張 力2， 向 勇2， 馬國平3△

1復旦大學附屬浦東醫(yī)院麻醉科，上海 2013992湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院疼痛科，十堰 4420003上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院麻醉科，上海 201318

目的 探討海馬區(qū)血小板活化因子(PAF)合酶(LPCAT1、LPCAT2)及其受體(PAFR)在大鼠坐骨神經分支選擇性神經損傷(SNI)所致神經病理性疼痛中的作用。方法 選擇海馬區(qū)置管成功的雄性SD大鼠40只，隨機分為4組(n=10)：假手術組(Sham組)，模型組(SNI組)，模型+銀杏內酯B組(SNI+BN52021組)和溶劑對照組(SNI+HBC組)。SNI+BN52021組在SNI手術后2 d通過海馬區(qū)微量注射給予銀杏內酯B 10 μg(溶解于1 μL的HBC溶液)，SNI+HBC組則給予1 μL的HBC溶液。分別于術前1 d和術后1、3、5、7、10、14 d記錄各組動物的機械縮爪閾值(PWMT)和輻射熱縮爪潛伏期(PWTL)；第15天取大鼠新鮮海馬組織，RT-PCR檢測LPCAT1、LPCAT2以及PAFR的表達。結果 SNI大鼠PWMT值術后第1天開始明顯降低(P<0.05)，海馬組織中LPCAT2及PAFR的表達增強(均P<0.05)，LPCAT1的表達變化不明顯(P>0.05)；海馬區(qū)微量注射BN52021組大鼠的PWMT值升高，海馬組織中LPCAT2及PAFR的表達下降(均P<0.05)。結論 海馬區(qū)微量注射銀杏內酯B可減輕SNI大鼠的機械性痛敏，抑制海馬區(qū)LPCAT2和PAFR的表達，海馬區(qū)PAF/PAFR信號通路可能參與了SNI大鼠神經病理性疼痛機制。

銀杏內酯B； 神經病理性疼痛； 海馬； 血小板活化因子

血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)是體內重要的磷脂類遞質，PAF及其受體參與慢性疼痛的中樞敏化機制。銀杏內酯B(Ginkgolide B，BN52021)是PAF受體(platelet-activating factor receptor，PAFR)特異性拮抗劑，海馬區(qū)微量注射BN52021可減輕甲醛誘導的炎性痛[1]。Okubo等[2]的研究證實，脊髓背角PAF合酶(LPCAT1、LPCAT2)及其受體的表達上調參與了選擇性神經損傷(spared nerved injury，SNI)大鼠的神經病理性疼痛，而鞘內注射銀杏內酯B可以減輕SNI大鼠的機械性異常痛敏，抑制神經損傷后脊髓背角c-fos的表達[3]。本研究通過觀察海馬區(qū)微量注射銀杏內酯B對SNI大鼠痛閾和海馬組織PAF合酶及其受體表達的影響，進一步探討銀杏內酯B對神經病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效應及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體重250～300 g，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(鄂)2011-0031。

1.2 儀器設備

電子自動爪測痛儀(electronic von Frey anesthesiometer，IITC公司，美國)；輻射熱測痛儀(Model 390G型，IITC公司，美國)。

1.3 試劑

銀杏內酯B購自Sigma公司，溶解于45%的羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HBC)溶液；HBC購自北京百威靈生物科技公司，溶解于無菌雙蒸水形成45%的HBC溶液；PCR試劑盒購自康為世紀公司。

1.4 神經病理性疼痛模型的建立及分組

40只大鼠隨機分成4組，假手術組(Sham組)、SNI手術組、SNI+HBC對照組以及SNI+BN52021組。參考Gurtskaia等[4]的方法行海馬區(qū)置管術7 d后，參照Decosterd等[5]的方法建立SNI神經病理性疼痛模型。SNI手術后第2天經預置頭部的導管給藥：銀杏內酯B治療組選擇1 μL微量進樣器緩慢注入銀杏內酯B(10 μg/μL)，SNI+HBC對照組則給予45%的HBC溶液1 μL。藥物配制方法、給藥劑量的選擇見參考文獻[5]。

1.5 行為學檢測

建立SNI模型前1 d測定基礎痛閾，手術后1、3、5、7、10和14 d分別測定大鼠熱痛閾和機械痛閾，測定時間恒定于每日9：00～15：00，室溫維持在(25±1)℃。參照Vivancos等[6]的方法，采用電子自動爪測痛儀檢測大鼠機械縮爪閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)；參照Hargreaves等[7]的方法，采用輻射熱測痛儀檢測輻射熱縮爪潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。

1.6 海馬組織LPCAT1、LPCAT2及PAFR表達的RT-PCR檢測

各組大鼠在SNI術后15 d斷頭處死，隨機選取6只大鼠的新鮮海馬組織，預冷PBS溶液沖洗去除殘留血液，取100 mg海馬組織于勻漿器中，用Trizol試劑提取總RNA，然后分光光度計檢測A260 nm/A280 nm比值。PCR試劑盒(2×Taq MasterMix，目錄號：CW0682)檢測海馬組織中PAF合酶LPCAT1、LPCAT2及其受體PAFR的表達。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠分析軟件處理，以LPCAT1、LPCAT2、PAFR與β-actin的比值表示其表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 海馬區(qū)微量注射銀杏內酯B對SNI大鼠神經病理性疼痛的影響

Sham組大鼠術前與術后PWMT未見明顯變化，SNI組、SNI+HBC組大鼠于手術后1 d左后肢出現(xiàn)機械性痛覺超敏，至術后7 d達到最低閾值并在觀察時間內維持穩(wěn)定，與SNI組相比，SNI+BN52021組大鼠術后各時點痛閾值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖1。各組大鼠PWTL差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠機械縮爪閾值的比較Fig.1 Comparison of paw withdrawal mechanical threshold in rats of different groups

圖2 各組大鼠輻射熱縮爪潛伏期的比較Fig.2 Comparison of paw withdrawal thermal latency in rats of different groups

2.2 海馬區(qū)微量注射銀杏內酯B對SNI大鼠海馬組織中PAF合酶及其受體表達的影響

與Sham組相比，SNI組、SNI+HBC組大鼠海馬組織中LPCAT1基因表達增加不明顯(均P>0.05)，LPCAT2、PAFR表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與SNI組和SNI+HBC組比較，SNI+BN52021組大鼠海馬區(qū)LPCAT2、PAFR基因表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖3和圖4。

A：Sham組；B：SNI組；C：SNI+BN52021組；D：SNI+HBC組圖3 各組大鼠海馬區(qū)LPCAT1、LPCAT2和PAFR表達的RT-PCR電泳圖Fig.3 RT-PCR electrophorogram of LPCAT1，LPCAT2 and PAFR in hippocampus of rats of different groups

與Sham組比較，*P<0.05；與SNI+BN52021組比較，▲P<0.05圖4 各組大鼠海馬區(qū)LPCAT1、LPCAT2和PAFR的表達Fig.4 RT-PCR analysis of LPCAT1，LPCAT2 and PAFR in hippocampus of rats of different groups

3 討論

PAF是一種具有多種生物活性的內源性磷脂類介質，由Ca2+依賴性細胞型磷脂酶A2(cPLA2)催化甘油磷脂產生PAF的前體LysoPAF，再通過PAF合酶，即溶血卵磷脂?；D移酶1(lysophosphatidylcholine acyltransferase 1，LPCAT1)和LPCAT2的作用使LysoPAF轉變?yōu)镻AF，PAF通過與G-蛋白耦聯(lián)的特異性PAF受體結合發(fā)揮其生物效應。研究表明，LPCAT1在生理條件下即可表達，屬于不依賴于炎癥信號刺激的結構型合酶，而LPCAT2在炎癥刺激的病理生理條件下誘導產生并發(fā)揮作用，屬誘生型合酶[8]。

PAF在神經組織中廣泛存在，中樞神經元及神經膠質細胞均可產生PAF。體外實驗表明，大腦皮質神經元、小膠質細胞、小腦顆粒細胞和海馬神經元在相應的刺激下可產生和釋放PAF。大量研究表明，PAF可能參與了疼痛信號的轉導和調控過程。鞘內注射PAF可誘發(fā)小鼠的機械性痛敏和熱痛敏，而腹腔注射PAF受體拮抗劑BN52021則可以減輕甲醛誘導的炎性傷害感受反應[9]。Tsuda等[10]發(fā)現(xiàn)，PAF受體基因敲除的小鼠生理狀態(tài)下對熱和機械刺激呈現(xiàn)正常反應，而局部注射甲醛和辣椒素以及內臟炎癥誘發(fā)的炎性痛小鼠則表現(xiàn)為疼痛反應減輕，同時，參與初級感覺神經元敏化的重要激酶——細胞外信號相關蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化水平降低，研究結果表明PAF及其受體在組織損傷所誘發(fā)的初級感覺神經元敏化及慢性疼痛中發(fā)揮著重要作用。

海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，研究表明，長期慢性疼痛伴有海馬區(qū)的異常變化，包括ERK的表達和磷酸化水平減弱、神經元再生的減少以及短時程突觸可塑性的改變。另有研究證實，海馬區(qū)微量注射非甾體類鎮(zhèn)痛藥可通過激活內源性阿片系統(tǒng)產生抗傷害感受性作用[4]；給予PAF的膜受體拮抗劑BN52021則能夠減輕甲醛誘導的炎性疼痛，PAF能夠激活海馬CA1區(qū)多種蛋白激酶，誘導突觸易化，增加神經突觸的效能[1]。本實驗研究表明，外周神經損傷可導致大鼠產生機械性痛敏，同時伴有海馬內的PAF合酶LPCAT2和PAF受體表達增加，而LPCAT1表達增加不明顯。海馬區(qū)微量注射銀杏內酯B可減輕SNI的機械性痛敏，并且抑制海馬內LPCAT2和PAF受體表達增強，對LPCAT1的表達無明顯影響。本研究結果證實了海馬區(qū)PAF和PAFR信號通路在神經病理性疼痛中的作用，通過拮抗PAF受體可調控LPCAT2的表達進而影響PAF的產生。

綜上所述，外周神經損傷可誘發(fā)大鼠機械性痛敏，海馬區(qū)PAF合酶及PAFR的表達上調參與其敏化機制。銀杏內酯B作為PAF的膜受體拮抗劑，可通過影響海馬內LPCAT2及PAFR的表達，抑制神經病理性疼痛的中樞敏化。

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(2017-03-14 收稿)

Roles of Platelet-activation Factor Synthases and Its Receptor in Neuropathic Pain Induced by Spared Nerve Injury in Hippocampus of Rats

Yang Jingli1，Zhang Li2，Xiang Yong2etal

1Department of Anesthesiology，the Affiliated Shanghai Pudong Hospital of Fudan University，Shanghai 201399，China2Department of Pain Clinic，the Affiliated Taihe Hospital of Hubei Medical University，Shiyan 442000，China

Objective To investigate the roles of platelet-activating factor(PAF)synthases(LPCAT1 and LPCAT2)and its receptor(PAFR)in neuropathic pain induced by spared nerve injury(SNI)in hippocampus.Methods Totally，40 SD rats with the cannula stereotaxically implanted into the dorsal hippocamus were randomly divided into 4 groups：Sham group，SNI group，Ginkgolide B group(SNI+BN52021 group)and vehicle control group(SNI+HBC group).The rats in SNI+BN52021 group were administered by intrahippocampal injection with Ginkgolide B 10 μg/μL 2 days after SNI surgery，and the rats in SNI+HBC group were administered by intrahippocampal injection with 45% HBC 1 μL.The paw withdrawal mechanical threshold(PWMT)and paw withdrawal thermal latency(PWTL)were recorded 1 day before surgery and 1，3，5，7，10 and 14 days after surgery.The expression of PAF synthases(LPCAT1 and 2)and PAF receptor(PAFR)in hippocampus were detected by RT-PCR.Results PWMT decreased significantly 1 day after surgery in SNI group(P<0.05).The expression levels of LPCAT2 and PAFR were increased significantly in hippocampus in SNI group(P<0.05).PWMT increased significantly in SNI rats administered by intrahippocampal injection with Ginkgolide B(P<0.05)，and the expression of LPCAT2 and PAFR decreased significantly in hippocampus in SNI+BN52021 group(P<0.05).Conclusion Intrahippocampal injection with Ginkgolide B could decrease the expression of LPCAT2 and PAFR，and alleviate mechanical hyperalgesia.It suggests that PAF/PAFR in hippocampus participates in the mechanism of neuropathic pain after SNI surgery.

Ginkgolide B； neuropathic pain； hippocampus； platelet-activating factor

*湖北省教育廳科研基金資助項目(No.D20132405);上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生人才培養(yǎng)計劃資助項目(No.PWRd2014-19)

R745.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.017

楊京利，女，1977年生，副主任醫(yī)師，E-mail：yangjinglisy@126.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：gpmshiyan@126.com