許美霞， 鄒麗絹， 張曉霞， 楊 濤， 許 濤

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430034

Kv1.5蛋白在內(nèi)毒素致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機制*

許美霞， 鄒麗絹， 張曉霞， 楊 濤， 許 濤△

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430034

目的 研究Kv1.5蛋白在內(nèi)毒素致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機制。方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，給予脂多糖(LPS)刺激建立膿毒癥模型，并分為：空白對照組、LPS組、LPS+Kv1.5蛋白通道特異性阻滯劑MT1(250 nmol/L)組及LPS+MT2(500 nmol/L)組，DAPI染色免疫熒光觀察各組HUVECs凋亡情況，Western blot檢測Caspase-3及Bcl-2蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測Caspase-3及Bcl-2基因的表達(dá)。結(jié)果 DAPI染色免疫熒光顯示，LPS組內(nèi)皮細(xì)胞核固縮、凋亡小體形成，凋亡小體形成率由空白對照組的(4.2±0.7)%增加至(26.7±0.8)%(P<0.01)，而250 nmol/L、500 nmol/L MT預(yù)處理后，凋亡小體形成率從LPS組(26.7±0.8)%分別下降至(12.4±1.0)%、(8.5±0.9)%(均P<0.01)；Western blot檢測結(jié)果顯示，LPS組較空白對照組Bcl-2蛋白表達(dá)減少、Caspase-3蛋白表達(dá)增加(均P<0.01)，給予500 nmol/L MT預(yù)處理后，與LPS組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)、Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.01)；RT-PCR檢測結(jié)果顯示，LPS組較空白對照組Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)、Caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)(均P<0.01)，給予500 nmol/L MT預(yù)處理后，與LPS組比較，Bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)、Caspase-3 mRNA表達(dá)下調(diào)(均P<0.01)。結(jié)論Kv1.5介導(dǎo)膿毒癥相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。

Kv1.5蛋白； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； MT(mephetyl tetrazole)； 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷

Kv1.5蛋白是一類電壓依賴性氧敏感鉀離子通道，在細(xì)胞的增殖、凋亡及炎癥等病理過程中發(fā)揮重要作用，已經(jīng)證實Kv1.5蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞中存在表達(dá)，并參與內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[1-2]。近期研究表明，Kv1.5蛋白與H2O2、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)等誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[3]。本研究通過建立膿毒癥模型，并給予Kv1.5蛋白通道特異性阻滯劑(MT，mephetyl tetrazole)干預(yù)后，觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況，并檢測內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2蛋白及基因的表達(dá)，以探討Kv1.5是否通過線粒體凋亡途徑介導(dǎo)膿毒癥相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購自中國科學(xué)院細(xì)胞資源庫。LPS購于Sigma公司，MT購于美國Santa Cruz公司，Caspase-3及Bcl-2一抗購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)

將凍存的HUVECs活化后，用含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，12 h后更換新培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長貼壁率達(dá)80%以上進行消化傳代，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，選取細(xì)胞狀態(tài)良好的HUVECs進行實驗。

1.3 膿毒癥相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型建立

HUVECs常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，給予濃度5 μg/mL LPS刺激HUVECs共24 h。

1.4 實驗分組

將HUVECs隨機分為空白對照組、LPS組、LPS+MT1組、LPS+MT2組。空白對照組：完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；LPS組：給予5 μg/mL LPS+培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；LPS+MT1組：予以250 nmol/L的MT預(yù)處理30 min后，給予5 μg/mL LPS+培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；LPS+MT2組：予以500 nmol/L的MT預(yù)處理30 min后，給予5 μg/mL LPS+培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.5 DAPI染色免疫熒光觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況

各組細(xì)胞按照分組分別處理后，用4%的多聚甲醛固定15 min，用DAPI染核20 min，在熒光顯微鏡下拍攝細(xì)胞圖像觀察細(xì)胞核形態(tài)。熒光顯微鏡下可見，活細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻熒光，而凋亡的細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的顆粒塊狀熒光，核出現(xiàn)固縮，可見DNA熒光碎片(凋亡小體)。分別選取5個視野，計數(shù)100個細(xì)胞，計算凋亡小體形成率=凋亡小體數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)×100%，取5次結(jié)果的平均值。

1.6 Western blot檢測Caspase-3及Bcl-2蛋白的表達(dá)

收集待測組織樣品，BCA試劑盒測定待測樣品蛋白濃度。用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。其中一抗用5%BSA封閉液按1∶200稀釋，4℃孵育過夜。二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG)用5%BSA封閉液按1∶2 000稀釋，室溫孵育2 h。用ECL顯影。

1.7 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平

用Trizol法提取總RNA，按Fermentas試劑盒說明書方法進行Real-time PCR檢測，引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄cDNA反應(yīng)條件：25℃ 5 min，50℃15 min，85℃ 5 min，4℃10 min；30個循環(huán)，72℃ 4 min，4℃ 4 min；Real-time PCR反應(yīng)條件：第一循環(huán)50℃ 2 min，95℃ 10 min，之后95℃ 30 s和60℃ 30 s共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法測得mRNA的表達(dá)量，并以各組與空白對照組的比值反映mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DAPI染色免疫熒光觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況

LPS組內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡核形態(tài)學(xué)的改變，與空白對照組比較，細(xì)胞核不同程度固縮、凋亡小體形成增加，給予MT預(yù)處理后，可明顯改善細(xì)胞凋亡情況(圖1)。通過凋亡小體計算統(tǒng)計，LPS組凋亡小體形成率由空白對照組的(4.2±0.7)%增加至(26.7±0.8)%(P<0.01)，而250 nmol/L、500 nmol/L MT預(yù)處理后，凋亡小體形成率從LPS組(26.7±0.8)%分別下降至(12.4±1.0)%、(8.5±0.9)%(均P<0.01)。

2.2 各組內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3及Bcl-2蛋白的表達(dá)水平

LPS組較空白對照組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，給予MT 250 nmol/L及500 nmol/L預(yù)處理后，與LPS組比較，Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.01)(圖2)。而LPS組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于空白對照組，給予MT 500 nmol/L預(yù)處理，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(圖2)。提示LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，給予MT預(yù)處理可上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)。

A：空白對照組；B：LPS組；C：LPS+MT1組；D：LPS+MT2組；箭頭所示為凋亡小體圖1 DAPI染色免疫熒光觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況(DAPI染色，×200)Fig.1 Apoptosis of HUVECs detected by DAPI staining(DAPI staining，×200)

①空白對照組；②LPS組；③LPS+MT1組；④LPS+MT2組；與空白對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01圖2 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3及Bcl-2蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Protein expression of Caspase-3 and Bcl-2 in each group

2.3 各組內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平

LPS組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平較空白對照組增加(P<0.01)，給予MT預(yù)處理后，Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)(圖3)；而LPS組Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平較空白對照組降低(P<0.01)，給予MT預(yù)處理后，Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平與LPS組比較表達(dá)上調(diào)(圖3)。提示LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷時，下調(diào)了Bcl-2基因表達(dá)、上調(diào)Caspase-3基因表達(dá)，給予MT 250 nmol/L及500 nmol/L預(yù)處理可下調(diào)Caspase-3基因表達(dá)，而予以MT 500 nmol/L預(yù)處理，可上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)。

①空白對照組；②LPS組；③LPS+MT1組；④LPS+MT2組；與空白對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01圖3 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平Fig.3 Expression of Caspase-3 mRNA and Bcl-2 mRNA in each group

3 討論

膿毒癥及其相關(guān)病變膿毒性休克是臨床常見的急危重癥，病死率居高不下[4-5]。LPS是引起革蘭陰性菌膿毒癥及膿毒癥休克的最主要原因，而其中內(nèi)皮細(xì)胞是LPS作用的重要靶器官，LPS通過氧化脂質(zhì)反應(yīng)等途徑直接或間接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致微循環(huán)障礙、膿毒性休克[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)Kv1.5蛋白參與H2O2、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)等誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[3]。我們前期研究證實Kv1.5蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在表達(dá)，給予LPS處理后，發(fā)現(xiàn)Kv1.5蛋白表達(dá)增加，提示Kv1.5蛋白可能與LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。本研究通過LPS建立膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，并給予MT干預(yù)后，觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)LPS組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增加，而給予MT預(yù)處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有所減少，進一步證實Kv1.5蛋白與膿毒癥相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)。

哺乳動物細(xì)胞凋亡主要有2種途徑即細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)途徑，兩者最終通過活化的Caspase家族蛋白導(dǎo)致細(xì)胞裂解[7]。細(xì)胞外途徑是膜受體介導(dǎo)的信號通路途徑，而細(xì)胞內(nèi)途徑即線粒體途徑。線粒體途徑主要受Bcl-2家族蛋白的調(diào)控。Bcl-2位于線粒體外膜，其高表達(dá)可以保護線粒體膜的完整性，避免線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C等凋亡因子的釋放，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡功能[8]。Caspase-3是位于胞質(zhì)內(nèi)的凋亡蛋白，受細(xì)胞色素C等凋亡因子的調(diào)控，其高表達(dá)可以促進細(xì)胞的裂解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。內(nèi)皮細(xì)胞對于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體損傷極敏感。而氧化應(yīng)激損傷在膿毒癥發(fā)生發(fā)展的病理過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。因此我們推測膿毒癥相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是通過線粒體途徑完成的。我們的研究顯示，膿毒癥細(xì)胞模型組Bcl-2 mRNA低表達(dá)、Caspase-3 mRNA高表達(dá)，提示LPS通過線粒體途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而給予Kv1.5蛋白特異性通道阻滯劑MT后，Bcl-2 mRNA的表達(dá)有所增加、Caspase-3 mRNA表達(dá)減少，同樣從蛋白表達(dá)水平也發(fā)現(xiàn)予以MT預(yù)處理后，Bcl-2蛋白的表達(dá)上調(diào)、Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，提示MT減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MT通過阻斷Kv1.5蛋白通道，減輕LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并上調(diào)Bcl-2基因、蛋白的表達(dá)、下調(diào)Caspase-3基因、蛋白的表達(dá)，表明Kv1.5蛋白可能通過線粒體途徑介導(dǎo)膿毒癥相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

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(2017-03-12 收稿)

Effect of Kv1.5 on Edotoxin-induced Endothelial Cell Injury

Xu Meixia，Zou Lijuan，Zhang Xiaoxiaetal

Critical Care Department，Wuhan Puai Hospital，Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Whuan 430034

Objective To study mechanism by which Kv1.5 protein promoted edotoxin-induced endothelial cell injury.Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)were culturedinvitroand LPS was used to establish sepsis model.The cells were randomly divided into four goups：blank control group，LPS group，LPS+mephetyl tetrazole(MT)1(250 nmol/L)group and LPS+MT2(500 nmol/L)group.DAPI staining was used to observe the apoptosis of HUVECs in each group.Western blotting was used to detect expression of Caspase-3 and Bcl-2.The mRNA expression of Caspase-3 and Bcl-2 was detected by RT-PCR.Results DAPI staining showed that the rate of apoptotic body formation in LPS group increased from(4.2±0.7)%(blank control group)to(26.7±0.8)%(P<0.01)，and after pretreatment with 250 nmol/L，and 500 nmol/L MT，the rate of apoptotic body formation decreased from(26.7±0.8)% to(12.4±1.0)% and(8.5±0.9)%，respectively(bothP<0.01).Compared with control，the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased and Caspase-3 in LPS group was increased (bothP<0.01).Compared with LPS group，after pretreatment with 500 nmol/L MT，the expression of Bcl-2 protein was significanlty increased and Caspase-3 was decreased (bothP<0.01).The expression of Bcl-2 mRNA in LPS group was down-regulated and Caspase-3 mRNA was up-regulated，as compared with control group (bothP<0.01).Compared with LPS group，after pretreatment with 500 nmol/L MT,the expression of Caspase-3 mRNA was down-regulated and Bcl-2 mRNA was up-regulated detected by RT-PCR(bothP<0.01).Conclusion Kv1.5 may mediate LPS-related HUVECs damage via the mitochondrial-ROS-vascular endothelial cell pathway.

Kv1.5 protein； human umbilical vein endothelial cells； mephetyl tetrazole； endothelial cell injury

*武漢市衛(wèi)生計生委科研基金資助項目(No.wx14c64)；湖北省自然科學(xué)基金資助項目(No.ZRY2014001335)

R826.61

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.015

許美霞，女，1982年生，主治醫(yī)師，E-mail：157006188@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：5955098@qq.com