劉順芳, 董可帥 , 張尊義 , 董漢華△

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院 1腫瘤科 2肝臟外科,武漢 430030

HBx基因誘導(dǎo)肝卵圓細胞惡性轉(zhuǎn)化并促進其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移*

劉順芳1, 董可帥2, 張尊義2, 董漢華2△

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院1腫瘤科2肝臟外科,武漢 430030

目的 研究HBx對肝卵圓細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法 以穩(wěn)定表達HBx的轉(zhuǎn)基因卵圓細胞株pEGFP-HBx-LE/6為實驗組，pEGFP-LE/6卵圓細胞為對照組。使用Western blotting、Transwell細胞侵襲實驗、劃痕實驗、CCK-8等檢測pEGFP-HBx-LE/6在細胞周期、分化標志物以及增殖轉(zhuǎn)移能力方面的變化。結(jié)果 ①實驗組細胞體積增大、具有明顯異形性，CK-19、CK-7表達明顯下降，AFP、HNF-4α表達升高；②實驗組細胞的增殖能力明顯升高，克隆形成能力、侵襲能力、劃痕恢復(fù)能力明顯增強；③與對照組比較，實驗組E-cadherin表達水平明顯下降，而N-cadherin、α-SMA、Vimentin表達水平明顯上升。結(jié)論 HBx基因可誘導(dǎo)肝卵圓細胞向惡性轉(zhuǎn)化，并促進其轉(zhuǎn)移。

卵圓細胞； HBx； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

肝卵圓細胞被認為是肝臟前體干細胞，體內(nèi)外實驗證實其可以根據(jù)局部微環(huán)境的不同分化為多種細胞，并且參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程[1]。目前肝細胞癌的治療難點主要在于肝切除術(shù)后容易復(fù)發(fā)、容易伴發(fā)肝內(nèi)播散及血管侵犯。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)動物以及人肝切除術(shù)后標本均可發(fā)現(xiàn)卵圓細胞增殖明顯增強，肝內(nèi)種植轉(zhuǎn)染了乙型肝炎病毒X基因(HBx)的卵圓細胞可以導(dǎo)致原位發(fā)生肝細胞癌[2]，肝內(nèi)微環(huán)境的改變可以顯著改變肝卵圓細胞的分化狀態(tài)，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。但是目前對于肝臟前體干細胞與肝細胞癌伴發(fā)肝內(nèi)播散以及血管侵犯的關(guān)系并不清楚。為此我們將攜帶HBx的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大鼠卵圓細胞(LE/6)并進一步觀察其侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，為肝卵圓細胞作為肝癌起源提供進一步的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

波形蛋白(Vimentin)、細胞角蛋白(CK-7、CK-19)、HBx、甲胎蛋白(AFP)、肝細胞核因子4α(HNF-4α)、上皮鈣黏素(E-cadherin)、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等的抗體均購自Santa Cruz公司(美國)，胎牛血清購自Gibco公司(美國)，OPTI-MEM和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司(美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

大鼠肝卵圓細胞LE/6細胞株由美國華盛頓大學(xué)病理科Nelson Fausto教授饋贈，使用含有10%胎牛血清、1 μg/mL胰島素(Sigma公司)、0.5 μg/mL氫化可的松(Sigma公司)的Ham’s F-10培養(yǎng)液(Gibco公司)在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

選擇對數(shù)生長期的LE/6細胞，當6孔培養(yǎng)板細胞匯合度達到80%時，經(jīng)10 μL的Lipofectamine2000(用OPTI-MEM稀釋)介導(dǎo)pEGFP-HBx或者pEGFP轉(zhuǎn)染LE/6。6 h后將培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的F-10培養(yǎng)液。

1.4 Western blot檢測

使用RIPA蛋白裂解液在冰上裂解肝癌、癌周組織以及培養(yǎng)細胞，按常規(guī)方法提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，將40 μg蛋白加至10%SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)電泳，按常規(guī)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)上，用含5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖液(TBST)37℃封閉1 h，然后加入相應(yīng)一抗，4℃搖床中過夜，TBST洗滌10 min×3次，加入相應(yīng)的稀釋二抗在37℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑孵育PVDF膜后，放入圖像采集儀器中，采集圖像。

1.5 細胞增殖能力檢測

CCK-8檢測：取對數(shù)生長期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6細胞，于10%胰酶消化1 min后，分別計數(shù)，按每孔1 000細胞平鋪于96孔板，每組各設(shè)3個復(fù)孔，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，分別于貼壁后24、48、72、96 h按培養(yǎng)液∶CCK-8原液=10∶1加入培養(yǎng)液中，常溫孵育1 h后，檢測其460 nm處吸光度值?？寺⌒纬蓪嶒灒喝?shù)生長期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6細胞，于10%胰酶消化1 min后，分別計數(shù)，按每孔100細胞平鋪于6孔板，每組各設(shè)3個復(fù)孔，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，吸棄培養(yǎng)液。加入甲醛溶液固定10 min，吸棄上清后加入結(jié)晶紫染液染色5～10 min，圖像檢測。

1.6 細胞侵襲能力檢測

劃痕實驗取對數(shù)生長期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6細胞，于10%胰酶消化1 min后，分別計數(shù)，按每孔1×105細胞將其平鋪于6孔板，于恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察，待其匯合度達到100%后，將培養(yǎng)液換為不含血清的F-10培養(yǎng)液，取10 μL移液器槍頭在培養(yǎng)皿輕輕劃出一痕跡，于0、4、8、12 h于倒置顯微鏡下拍照觀察劃痕恢復(fù)情況，計算測量時劃痕寬度與初始劃痕寬度的比值。Transwell細胞侵襲實驗：將Matrigel膠質(zhì)置于冰上靜置1 h，待其液化，迅速吸取10 μL與40 μL無血清DMEM培養(yǎng)液混合均勻，加入到Transwell小室。置于37℃靜置40 min，待其風(fēng)干。將Transwell小室放入24孔細胞培養(yǎng)板，在上室加入300 μL DMEM培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍，用無血清DMEM調(diào)整細胞密度至107/mL，加入100 μL于Transwell小室內(nèi)。于下室中加入500 μL含10%FBS的DMEM。于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，染色計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果中的計量指標以±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染HBx基因后可直接誘導(dǎo)肝卵圓細胞向惡性轉(zhuǎn)化

實驗組pEGFP-HBx-LE/6細胞體積比對照pEGFP-LE/6明顯增大、具有明顯異形性。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)實驗組中卵圓細胞標志物CK-19、CK-7表達明顯下降，而肝臟腫瘤標志物AFP和肝細胞標志物HNF-4α的表達量明顯升高(圖1)，說明轉(zhuǎn)入HBx后，卵圓細胞有分化并向惡性轉(zhuǎn)化的趨勢。

①：LE/6；②：pEGFP-LE/6；③：pEGFP-HBx-LE/6；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx后，卵圓細胞標志物(CK-19、CK-7)表達量下降，肝臟腫瘤標志物AFP和肝細胞標志物HNF-4α表達量升高*P<0.05
圖1 Western blotting法檢測細胞因子表達變化
Fig.1 Western blotting to detect the changes of cytokine expression

2.2 pEGFP-HBx-LE/6細胞增殖能力、侵襲能力的變化

CCK-8法檢測顯示實驗組pEGFP-HBx-LE/6細胞增殖能力明顯提高，增殖速度明顯提高(P<0.05)(圖2A)，同時克隆形成實驗提示實驗組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx后，細胞克隆形成能力明顯增強，增殖速度明顯加快(圖2B、E)。劃痕實驗提示劃痕12 h以后，pEGFP-HBx-LE/6細胞劃痕恢復(fù)速度明顯加快(圖2C、F)，在Transwell侵襲實驗中，實驗組細胞轉(zhuǎn)移能力明顯增強(圖2D、G)。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx分子后，卵圓細胞的增殖能力明顯升高(A)，克隆形成能力(B、E)、劃痕恢復(fù)能力(C、F)、侵襲能力(D、G)明顯增強；*P<0.05圖2 穩(wěn)定表達HBx卵圓細胞增殖能力及侵襲能力的變化Fig.2 The change of proliferation ability and invasion ability in oval cells after stably expressing HBx

2.3 HBx與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)指標變化

進一步研究發(fā)現(xiàn)，實驗組pEGFP-HBx-LE/6細胞系中EMT相關(guān)指標(E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin)發(fā)生了明顯變化。LE/6細胞轉(zhuǎn)入HBx基因后，E-cadherin表達水平明顯下降，而間葉組織因子(N-cadherin、α-SMA、Vimentin)表達水平明顯上升(圖3)。提示EMT可能參與HBx誘導(dǎo)卵圓細胞系發(fā)生轉(zhuǎn)移。

①:pEGFP-LE/6;②:pEGFP-HBx-LE/6;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx分子后E-cadherin表達水平明顯下降，而N-cadherin，α-SMA，Vimentin表達水平明顯上升。圖3 Western blot法檢測EMT通路相關(guān)蛋白表達Fig.3 Western blotting to check the expression level of EMT associated molecules

3 討論

目前在各種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞[3]。肝卵圓細胞被認為是成年動物肝臟內(nèi)的成體干細胞，正常情況下處于休眠狀態(tài)，一般位于小葉間膽管和Hering’s管，具有自我增殖、自我更新和多向分化的能力，而這些特性與腫瘤干細胞極其相似。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化和肝癌組織中均有不同程度的卵圓細胞增殖，而在正常肝組織中未見其增殖。同時發(fā)現(xiàn)HBx基因在卵圓細胞中的整合率與其在肝硬化和肝癌組織中的整合率相似(85%)。這些結(jié)果都提示卵圓細胞可能通過轉(zhuǎn)染HBx基因而發(fā)生癌變。

已有較多實驗表明肝卵圓細胞在特定肝臟微環(huán)境中可以轉(zhuǎn)化為多種細胞[4-5]，而且已有相關(guān)研究表明在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)了肝卵圓細胞，表明肝癌可能起源于卵圓細胞的異常分化[1，6-8]。我國肝癌患者中80%合并有乙肝病毒，病程通常為肝炎、肝纖維化、肝硬化、最終形成肝癌。臨床上我們發(fā)現(xiàn)，肝臟腫瘤通常合并有早期肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或者門脈癌栓等情況，對于此類患者即使行手術(shù)切除，術(shù)后5年生存率亦很低[9-10]。因此我們推測肝癌發(fā)生以及侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生可能在疾病的初始過程就已經(jīng)發(fā)生。乙肝感染作為肝癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[11]，已經(jīng)有越來越多的研究表明HBx作為乙肝感染的重要分子在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[12]。HBx可以激活多種細胞轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、NF-κB以及CREB等從而調(diào)控靶基因的表達[13]。前期實驗中我們已經(jīng)證實，HBx可能促進肝卵圓細胞向惡性轉(zhuǎn)化[2，14]，我們推測HBx在肝臟腫瘤發(fā)生過程中可能起到促進轉(zhuǎn)移的作用。

本次研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染HBx基因后，肝臟卵圓細胞標志物表達下降，而肝臟細胞標志(白蛋白、HNF-4α)明顯升高，同時肝臟腫瘤標志AFP出現(xiàn)高表達。這表明在轉(zhuǎn)染HBx基因之后，肝卵圓細胞失去了干細胞特性，并有向肝惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的趨勢。通過進一步實驗研究證實，轉(zhuǎn)染HBx基因后，實驗組卵圓細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力明顯增強，同時EMT相關(guān)信號通路發(fā)生了顯著性改變，E-cadherin表達量明顯下降，而N-cadherin、α-SMA、Vimentin表達水平明顯上調(diào)，提示HBx基因可以通過EMT信號通路影響肝臟腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，肝卵圓細胞在HBx的誘導(dǎo)作用下可轉(zhuǎn)化為肝癌細胞，同時通過發(fā)生EMT過程增強其增殖及轉(zhuǎn)移能力。證實肝癌的發(fā)生可能是卵圓細胞轉(zhuǎn)染HBx后發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化形成，同時肝癌細胞的增殖以及早期轉(zhuǎn)移可能是同時發(fā)生的，而且與乙型肝炎病毒感染有著密切關(guān)系，但是其具體機制還有待進一步深入研究。

[1] Wang H Y，Yang S L，Liang H F，et al.HBx protein promotes oval cell proliferation by up-regulation of cyclin D1 via activation of the MEK/ERK and PI3K/Akt pathways[J].Int J Mol Sci，2014，15(3)：3507-3518.

[2] Li C H，Wang Y J，Dong W，et al.Hepatic oval cell lines generate hepatocellular carcinoma following transfection with HBx gene and treatment with aflatoxin B1invivo[J].Cancer Lett，2011，311(1)：1-10.

[3] Soeda J,Mouralidarane A,Kay S,et al.The β-adrenoceptor agonist isoproterenol rescues acetaminophen-injured livers through increasing progenitor numbers by Wnt in mice[J].Hepatology，2014,60(3)，1023-1034.

[4] Ji T，Li G，Chen J，et al.Distinct role of interleukin-6 and tumor necrosis factor receptor-1 in oval cell-mediated liver regeneration and inflammation-associated hepatocarcinogenesis[J].Oncotarget，2016，7(41)：66635-66646.

[5] Tan E K，Shuh M，F(xiàn)rancois-Vaughan H，et al.Negligible oval cell proliferation following ischemia-reperfusion injury with and without partial hepatectomy[J].Ochsner J，2017，17(1)：31-37.

[6] Pusterla T，Nemeth J，Stein I，et al.Receptor for advanced glycation endproducts(RAGE)is a key regulator of oval cell activation and inflammation-associated liver carcinogenesis in mice[J].Hepatology，2013，58(1)：363-373.

[7] Dong H H，Xiang S，Liang H F，et al.The niche of hepatic cancer stem cell and cancer recurrence[J].Med Hypotheses，2013，80(5)：666-668.

[8] Dong H H，Xiang S，Chen X P，et al.The epithelial-mesenchymal transition promotes transdifferentiation of subcutaneously implanted hepatic oval cells into mesenchymal tumor tissue[J].Stem Cells Dev，2009，18(9)：1293-1298.

[9] Keeffe E B.Risk score for development of HCC：ready for use in practice?[J].Lancet Oncol，2011，12(6)：517-518；discussion 8-9.

[10] Miyazaki M，Shimzu H，Ohtuka M，et al.Portal vein thrombosis after reconstruction in 270 consecutive patients with portal vein resections in hepatopancreatobiliary(HPB)surgery[J].Am J Surg，2016，214(1):74-79.

[11] Omino R，Mittal S，Kramer J R，et al.The validity of HCC diagnosis codes in chronic hepatitis B patients in the veterans health administration[J].Dig Dis Sci，2017，62(5)：1180-1185.

[12] Liu Y，Xu Y，Ma H，et al.Hepatitis B virus X protein amplifies TGF-beta promotion on HCC motility through down-regulating PPM1a[J].Oncotarget，2016，7(22)：33125-33135.

[13] Yang S T，Yen C J，Lai C H，et al.SUMoylated CPAP is required for IKK-mediated NF-kappaB activation and enhances HBx-induced NF-kappaB signaling in HCC[J].J Hepatol，2013，58(6)：1157-1164.

[14] 李常海，陳孝平，梁慧芳，等.HBx基因大鼠卵圓細胞株的建立及鑒定[J].中華外科雜志，2008，46(24)：1919-1922.

(2017-04-27 收稿)

HBx Gene Induces Malignant Transformation of Hepatic Oval Cells and Promotes Their Invasion and Metastasis

Liu Shunfang1，Dong Keshuai2，Zhang Zunyi2etal

1Department of Oncology，2Hepatic Surgery Center，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the effect of HBx gene on the tumorigenesis and metastatic ability of hepatic oval cells.Methods HBx gene or vector gene was transfected into hepatic oval cell line LE/6，serving as experimental group and control group，respectively.Western blotting，Transwell assay，and CCK-8 assay were applied to explore the effect of HBx gene on the tumorigenesis and metastatic ability of oval cells.Results ①The volume of cells in the experiment group was increased and the atypia was obvious.The expression of CK-19 and CK-7 was significantly decreased，and that of AFP and HNF-4α increased；②The proliferation of pEGFP-HBx-LE/6 cells was significantly increased.The colony forming ability，invasion ability and scratch recovery ability were enhanced obviously；③As compared with the control group，the expression level of E-cadherin was significantly decreased，and that of N-cadherin，α-SMA and Vimentin increased significantly in the experimental group.Conclusion HBx gene is confirmed to promote the metastatic ability and tumorigenesis of hepatic oval cells.

oval cells； HBx； epithelial mesenchymal transition

*國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(No.81402410，No.81602626)

R322.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.008

劉順芳，男，1982年生，主治醫(yī)師，E-mail：liushunfang28@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：hanhua_dong@hotmail.com