賀文煜， 袁昌勁

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，武漢 430014

鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬通過激活Caspase-3信號通路誘導乳腺癌細胞凋亡

賀文煜， 袁昌勁△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，武漢 430014

目的 探討鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬對乳腺癌細胞的影響及作用機制。方法 將乳腺癌細胞株MCF-7、T47D分為4組，對照組加入PBS，CA組加入鼠尾草酸，TAM組加入他莫昔芬，CA+TAM組加入鼠尾草酸和他莫昔芬。MTT增殖實驗檢測細胞增殖能力，集落形成實驗檢測細胞集落形成能力，Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力，免疫印跡法檢測各組細胞Caspase-8、Caspase-3、PARP蛋白表達。結(jié)果 在0～20 μmol/L藥物濃度時，CA、TAM、CA+TAM呈劑量依賴性抑制乳腺癌細胞增殖，但藥物濃度為20 μmol/L與50 μmol/L對細胞增殖影響差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。CA+TAM組增殖抑制率明顯高于CA組和TAM組(均P<0.05)。MCF-7和T47D細胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組集落形成率、侵襲細胞數(shù)、細胞遷移率顯著低于對照組(均P<0.05)；CA+TAM組集落形成率、侵襲細胞數(shù)、細胞遷移率顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組集落形成率、侵襲細胞數(shù)、細胞遷移率比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。在2種乳腺癌細胞株中，對照組、CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-8蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達顯著高于對照組(均P<0.05)，CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達顯著高于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。結(jié)論 鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬能夠抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與激活Caspase-3/PARP信號通路有關(guān)。

鼠尾草酸； 乳腺癌； 他莫昔芬； 侵襲； 遷移； 增殖； 信號通路

乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位[1]，盡管近20年來乳腺癌的診療技術(shù)得到了極大的提高，但其遠期生存率依然不容樂觀，其中放化療抵抗是導致乳腺癌治療失敗的主要原因[2]。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)是乳腺癌內(nèi)分泌治療常用的藥物之一，對雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)均陽性者有效率為60%～70%[3-4]。然而并非所有乳腺癌患者均能從TAM治療中獲益，特別是部分復(fù)發(fā)患者，乳腺癌細胞可能對TAM耐藥，導致治療失敗[5]。鼠尾草酸(carnosic acid，CA)是從唇形科植物迷迭香中提取的一種多酚類雙萜化合物，目前已證實CA具有廣泛的生物學活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等。有報道顯示[6]鼠尾草酸能抑制K562/AO2細胞膜上P糖蛋白的表達，有效逆轉(zhuǎn)人白血病細胞的多藥耐藥。然而關(guān)于CA對實體瘤的作用機制依然不清楚。本研究擬通過聯(lián)合CA、TAM處理乳腺癌細胞株，觀察其對細胞增殖、侵襲等生物學行為的影響及可能的作用機制，旨在為乳腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞來源和培養(yǎng)

乳腺癌細胞系MCF-7、T47D和正常人乳腺細胞MCF-10A購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，細胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，將培養(yǎng)液置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細胞保持貼壁生長，每隔2～3 d進行1次傳代。

1.2 實驗材料

RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，鼠尾草酸、他莫昔芬(純度>98%)均購自杭州大洋化工股份有限公司，RIPA裂解液、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自廣州碧云天生物技術(shù)研究所。BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo公司，Transwell小室、Matrigel人工基底膜購自美國BD公司，鼠抗人Caspase-8抗體、鼠抗人cleaved Caspase-8抗體、鼠抗人Caspase-3抗體、鼠抗人cleaved Caspase-3抗體、鼠抗人PARP抗體、鼠抗人cleaved PARP抗體、鼠抗人GAPDH抗體購自Santa Cruz公司，ECL顯色試劑盒購自美國Pierce Biotechnology公司，聚烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸鈉購自美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分組及處理 實驗前，將CA和TAM分別用DMSO稀釋成濃度為1、5、10、20、50 μmol/L，對照組加入等量PBS。按1×105/mL濃度將MCF-7、T47D、MCF-10A接種于6孔板中，1組加入等量DMSO作為對照，2組加入1 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，3組加入5 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，4組加入10 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，5組加入20 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，6組加入50 μmol/L CA或TAM或CA+TAM。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2濕度恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 MTT增殖實驗檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期細胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1×105/mL，接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，37℃、5%CO2濕度下培養(yǎng)。檢測前4 h，向每孔中加入MTT試劑(20 μL/孔)繼續(xù)孵育24 h，終止培養(yǎng)，1 000 g離心15 min，棄去上清液，每孔中加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶物，室溫下振蕩15 min，置于酶標儀上檢測570 nm處吸光度(A)值，以評價細胞生長能力。

1.3.3 集落形成實驗檢測細胞集落形成能力 藥物處理的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7 d，將克隆細胞用PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，Gimsa染色30 min，流水輕輕洗去染液，空氣干燥后鏡檢。集落形成效率=克隆細胞數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.3.4 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 用不含血清的培養(yǎng)液將轉(zhuǎn)染后細胞濃度調(diào)整為1.0×105個/mL，Transwell上室每孔接種150 μL細胞，下室加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為趨化劑，37℃培養(yǎng)48 h，多聚甲醛固定，蘇木精復(fù)染10 min，200倍熒光顯微鏡下觀察穿透濾膜的細胞數(shù)。

1.3.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將細胞接種于6孔板，待細胞融合度≥70%時進行劃痕實驗。用Marker筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線(確保每孔至少有4條線穿過)，每孔中鋪1×105個細胞，細胞融合度≥80%時用無菌移液槍槍頭在單層細胞沿底部劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3次，培養(yǎng)48 h后顯微鏡下測量劃痕的寬度，并計算細胞遷移率。

1.3.6 免疫印跡法(Western blot)檢測細胞Caspase-8、Caspase-3、PARP蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入離心管中，再加入1 mL細胞裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃條件下離心15 min，BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白純度。將20 μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶封閉孵育2 h。加入相應(yīng)的抗體(1∶1 000)鼠抗人Caspase-8抗體、Caspase-3抗體、PARP抗體、GAPDH抗體，4℃孵育24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次，按照ECL化學發(fā)光顯影試劑盒顯影，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析目的條帶相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CA聯(lián)合TAM對乳腺癌細胞增殖的影響

在藥物濃度為0～20 μmol/L時，CA、TAM、CA+TAM呈劑量依賴性抑制乳腺癌細胞增殖(圖1A、1B)，CA、TAM、CA+TAM處理后對正常乳腺細胞MCF-10A增殖率無明顯影響(均P>0.05，圖1C)。與空白組比較，當藥物濃度達到10、20、50 μmol/L時能明顯抑制乳腺癌MCF-7、T47D細胞的增殖(均P<0.05)，其中10、20、50 μmol/L時CA+TAM組增殖抑制率明顯高于CA組和TAM組(均P<0.05)。進一步分析顯示，20 μmol/L和50 μmol/L的藥物濃度對MCF-7、T47D細胞增殖率的影響差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，因此本研究選擇濃度為20 μmol/L的CA和20 μmol/L的TAM進行后續(xù)試驗。

A：對MCF-7細胞增殖的影響；B：對T47D細胞增殖的影響；C：對MCF-10A細胞增殖的影響；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05圖1 不同濃度CA、TAM對細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentration of CA and TAM on cell proliferation

2.2 CA聯(lián)合TAM對乳腺癌細胞集落形成的影響

在MCF-7和T47D細胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組集落形成率顯著低于對照組(均P<0.05)；CA+TAM組集落形成率顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組集落形成率比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖2。

A：CA聯(lián)合TAM對MCF-7細胞集落形成的影響；B：CA聯(lián)合TAM對T47D細胞集落形成的影響；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05圖2 CA聯(lián)合TAM對乳腺癌細胞集落形成的影響(Gimsa染色)Fig.2 Effects of CA combined with TAM on breast cell colony formation(Gimsa staining)

2.3 CA聯(lián)合TAM對乳腺癌細胞侵襲的影響

在MCF-7和T47D細胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組侵襲細胞數(shù)顯著低于對照組(均P<0.05)；CA+TAM組侵襲細胞數(shù)顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組侵襲細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖3。

2.4 CA聯(lián)合TAM對乳腺癌細胞遷移的影響

在MCF-7和T47D細胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組細胞遷移率顯著低于對照組(均P<0.05)；CA+TAM組細胞遷移率顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組細胞遷移率比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖4。

A：CA聯(lián)合TAM對MCF-7細胞侵襲能力的影響；B：CA聯(lián)合TAM對T47D細胞侵襲能力的影響；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05。圖3 CA聯(lián)合TAM對乳腺癌侵襲能力的影響(蘇木精-伊紅染色,×100)Fig.3 Effects of CA combined with TAM on breast cell invasion capacity (HE staining,×100)

A：CA聯(lián)合TAM對MCF-7細胞遷移能力的影響；B：CA聯(lián)合TAM對T47D細胞遷移能力的影響；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05圖4 CA聯(lián)合TAM對乳腺癌細胞遷移能力的影響(×100)Fig.4 Effects of CA combined with TAM on breast cell migration capacity (×100)

2.5 CA聯(lián)合TAM對Caspase-3信號通路的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，MCF-7和T47D細胞中，對照組、CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-8蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達顯著高于對照組(均P<0.05)；CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達顯著高于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖5。

A：MCF-7細胞凋亡蛋白表達水平；B：T47D細胞凋亡蛋白表達水平；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05 圖5 各組細胞凋亡蛋白表達水平Fig.5 Expression of apoptosis-related protein in earch group

3 討論

TAM是治療乳腺癌的常用藥物，然而并非所有乳腺癌患者均能從TAM治療中受益，特別是TAM首次治療后復(fù)發(fā)的患者，由于TAM耐藥導致后期治療失敗。在過去的幾十年里，大量從自然界中提取的有效單體，如生物堿、多酚類、黃酮類等化合物在抗腫瘤治療中起到重要的作用。鼠尾草酸是從唇形科迷迭香中提取的一類多酚類化合物，研究證實鼠尾草酸除了具有抗氧化作用，還具有抗炎、抗菌、抗病毒等活性[7-8]。陶萍華等[9]報道稱鼠尾草酸能夠保護氧自由基損傷的肝細胞，其作用機制與激活PI3K/Akt-Nrf2通路有關(guān)。

鼠尾草酸能夠通過誘導抑癌基因表達、促進癌細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖等方式發(fā)揮抗癌作用[10]。Kar等[11]報道稱鼠尾草酸以劑量和時間依賴性的方式抑制前列腺癌細胞的增殖，其作用機制與調(diào)節(jié)Akt/IKK/NF-κB通路激活磷酸酶2A有關(guān)。Roche等[12]則證實鼠尾草酸的結(jié)構(gòu)與β-連環(huán)蛋白酶抑制劑相似，在體內(nèi)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌增殖作用。除了自身抗腫瘤活性外，鼠尾草酸亦有協(xié)同抗癌活性。李顥等[13]報道顯示鼠尾草酸與姜黃素、三氧化二砷等聯(lián)合使用，能夠誘導Bax、Caspase-3等基因表達，進而促進急性髓性白血病細胞的分化。本研究采用鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬處理乳腺癌細胞，結(jié)果顯示CA、TAM、CA+TAM呈劑量依賴性抑制乳腺癌細胞增殖，且CA+TAM組增殖抑制率明顯高于CA組和TAM組，提示鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬能夠抗乳腺癌細胞增殖。但是正常乳腺細胞MCF-10A增殖率無明顯變化，提示CA+TAM對正常乳腺細胞增殖影響小，具有較高的安全性，這亦為乳腺癌治療提供了一個新的思路。鼠尾草酸還具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，Bobilev等[14]用20 μmol/L鼠尾草酸處理阿霉素耐藥的白血病細胞株AO2，結(jié)果顯示AO2細胞耐藥基因mdr1、p-gp明顯下調(diào)，使藥物外排減少，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。由于本研究未選擇TAM耐藥乳腺癌細胞株進行研究，因此尚無法判斷鼠尾草酸是通過協(xié)同抗癌還是抑制細胞耐藥發(fā)揮乳腺癌細胞增殖抑制的作用。

本研究進一步分析了鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬對乳腺癌細胞株水平運動能力的影響，結(jié)果顯示CA+TAM組集落形成率、侵襲細胞數(shù)、細胞遷移率均顯著低于CA組和TAM組，說明鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬具有抑制乳腺癌細胞運動和侵襲的作用，這也為乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移和增殖提供了潛在的治療策略。研究表明鼠尾草酸能夠通過多種作用機制抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Tai[15]等研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸能夠阻斷卵巢癌細胞的分裂周期，促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖。曲輝等[16]報道顯示鼠尾草酸通過抑制基底膜基質(zhì)蛋白的表達，發(fā)揮抑制腫瘤細胞遷移、侵襲的作用。Einbond等[17]采用不同劑量鼠尾草酸處理乳腺癌細胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量時鼠尾草酸能夠抑制細胞中谷胱甘肽的表達，高劑量時不僅能夠誘導促凋亡蛋白的表達，還能抑制細胞周期調(diào)節(jié)基因和轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達，抑制雌激素受體陰性的乳腺癌細胞的生長。

雖然部分研究發(fā)現(xiàn)了鼠尾草酸的抗腫瘤活性，但是關(guān)于其作用機制依然報道較少。研究證實絕大多數(shù)腫瘤細胞的凋亡最后均通過Caspase通路完成[18-19]，包括Cyto C介導線粒體凋亡途徑和TNF-α介導的死亡受體凋亡通路。Caspase屬于白介素-1轉(zhuǎn)化酶家族，Caspase-8、Caspase-3是位于凋亡通路上的2個關(guān)鍵基因。Caspase-8對來自細胞外的凋亡誘導因子的刺激作出應(yīng)答，以啟動細胞解體。Caspase-3則通過激活下游靶基因PARP，促進細胞全面自殺性解體。Kamal等[20]報道稱Caspase-3/PARP和Caspase-8信號通路均參與了藥物性誘導的乳腺癌細胞凋亡，并上調(diào)下游Bax、Bad、Bcl-2等凋亡基因表達，抑制乳腺癌細胞的增殖。為了進一步證實鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬抑制乳腺癌細胞可能的作用機制，本研究采用免疫印跡法檢測MCF-7和T47D細胞cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達，結(jié)果顯示4組細胞cleaved Caspase-8蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達顯著高于CA組和TAM組，提示鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬可能是通過激活Caspase-3/PARP信號通路抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲。

綜上所述，鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬能夠抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且對正常乳腺細胞無明顯毒性作用，其作用機制可能與激活Caspase-3/PARP信號通路有關(guān)。但是本研究僅進行了體外細胞研究，其動物體內(nèi)的安全性和有效性有待進一步證實。

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(2017-03-29 收稿)

Carnosic Acid Cooperates with Tamoxifen to Induce Apoptosis of Breast Cancer Cells through Caspase-3 Signaling Pathway

He Wenyu，Yuan Changjing△

Department of Oncology,Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，The Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430014，China

Objective To explore the effect of carnosic acid combined with tamoxifen on breast cancer cells and the mechanism.Methods Breast cancer cell lines MCF-7，T47D were divided into 4 groups：PBS was given to control group，carnosic acid(CA)was added to CA group，tamoxifen(TAM)was added to TAM group，and CA+TAM group was treated with carnosic acid and tamoxifen.The proliferation ability was measured by MTT assay，the colony formation capacity was measured by colony formation assay，the invasion ability was measured by Transwell chamber assay，the migration ability was measured by wound-healing assay，the expression of Caspase-8，Caspase-3 and PARP protein were measured by Western blotting.Results CA，TAM and CA+TAM suppressed breast cancer cell proliferation with a dose-dependent manner.Compared with CA group and TAM group，the proliferation inhibitory rate of CA+TAM group was significantly increased(P<0.05).In MCF-7 and T47D cell lines，compared to control group，the rate of colony fromation，number of invasive cells and cell migration rate of CA，TAM，CA+TAM groups were significantly decreased(allP<0.05).These indexes mentioned above in CA+TAM group were significantly lower than those in CA group and TAM group(allP<0.05)，but there were no significant differences between CA group and TAM group (allP>0.05).In two breast cancer cell strains，the expression of cleaved Caspase-8 protein between control，CA，TAM and CA+TAM groups was not significantly different(P>0.05).Compared to control group，the expression levels of cleaved caspase-3，cleaved PARP protein in CA，TAM and CA+TAM groups were significantly increased(P<0.05)，and these protein levels were significantly higher in CA+TAM group than in CA and TAM group(allP<0.05).But there were no significant differences between CA group and TAM group(allP>0.05).Conclusion Carnosic acid combined with tamoxifen can suppress the proliferation，invasion and migration of breast cancer cells，and its mechanism may be related to the activation of Caspase-3/PARP signaling pathway.

carnosic acid； breast cancer； tamoxifen； invasion； migration； proliferation； signaling pahway

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.007

賀文煜，女，1986年生，住院醫(yī)師，碩士研究生，E-mail:hewenyu86@163.com

△通訊作者，Correspongding author,E-mail:13607169125@139.com