王婭南， 魏亞寧， 徐 芳， 范翔宇， 張 培，李 赟， 王 盼， 張金庫， 鄭紅婧

河北大學附屬醫(yī)院 1病理科， 2腫瘤內(nèi)科，保定 071000 3河北省保定第一中心醫(yī)院病理科，保定 071028 4河北省保定市第七人民醫(yī)院病理科，保定 072150

miR-551b在人胃癌組織中的表達及對胃癌細胞凋亡的影響*

王婭南1， 魏亞寧2， 徐 芳1， 范翔宇1， 張 培1，李 赟1， 王 盼1， 張金庫3△， 鄭紅婧4

河北大學附屬醫(yī)院1病理科，2腫瘤內(nèi)科，保定 0710003河北省保定第一中心醫(yī)院病理科，保定 0710284河北省保定市第七人民醫(yī)院病理科，保定 072150

目的 探討miR-551b在人胃癌組織中的表達及對胃癌細胞凋亡的影響。方法 采用Real-time PCR檢測胃癌組織、正常胃組織miR-551b表達水平，分別將miRNA無義序列、miR-551b mimics、miR-551b inhibitors轉(zhuǎn)染至人胃癌細胞株SGC-7901，Real-time PCR檢測各組細胞miR-551b表達，MTT法檢測各組腫瘤細胞增殖活性，Transwell法檢測各組細胞侵襲能力，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況，Hoechst33342熒光染色觀察各組細胞自噬、凋亡的發(fā)生，Western blot檢測各組細胞NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達。結(jié)果 miR-551b在胃癌組織表達明顯下調(diào)，胃癌組織miR-551b相對表達量(1.75±0.13)顯著低于正常胃組織(2.47±0.38)(P<0.05)。與NC組和miR-551b inhibitors組比較，miR-551b mimics組miR-551b表達水平顯著上升，細胞增殖率和侵襲率顯著降低，細胞凋亡率明顯上升，各指標比較差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。Hoechst33342熒光染色顯示miR-551b mimics組出現(xiàn)大量自噬泡，NC組可見部分自噬泡，而miR-551b inhibitors組僅有少量自噬泡。Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC組和miR-551b inhibitors組比較，miR-551b mimics組NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。結(jié)論 miR-551b能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲等細胞生物功能，其作用機制可能是誘導(dǎo)了胃癌細胞發(fā)生自噬性凋亡。

微小RNA； 胃癌； 侵襲、 凋亡； 增殖； 自噬性凋亡

胃癌是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，全世界每年約93.4萬新增胃癌患者，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為是胃癌高死亡率的主要原因，也是導(dǎo)致胃癌治療失敗的主要誘因[3]。自噬[4](autophagy)作為真核細胞內(nèi)廣泛存在的降解和再循環(huán)系統(tǒng)，在廢物清除、結(jié)構(gòu)重建、細胞生長發(fā)育、蛋白代謝平衡和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用。微小RNA(miRNA)是一類長度約19～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，作為一類新的癌基因或者抑癌基因，其表達失衡與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究證實miRNA可以調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的表達，從而調(diào)控腫瘤的病理過程[5]。胃癌組織miR-551b呈低表達，上調(diào)miR-551b表達能夠抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示miR-551b在胃癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮著類似抑癌基因的作用[6]；但是對miR-551b的具體作用機制依然不清楚。本研究探討了miR-551b對人胃癌細胞株SGC-7901自噬性凋亡的誘導(dǎo)作用及可能的作用機制，為尋找胃癌治療的新靶點提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選擇2014年7月至2015年9月河北大學附屬醫(yī)院收治的48例胃癌病例，所有患者均經(jīng)病理學證實，病理檢查時切取部分胃癌組織，同時切取距瘤體邊緣10 cm的正常胃組織作為對照，所有標本取出后用醫(yī)用生理鹽水反復(fù)沖洗，并置于液氮中保存。本研究樣本采集均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 細胞與試劑

人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院細胞資源中心，MTT染料、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶(0.25%)購自HyClone公司，細胞裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1抗體，兔抗人β-actin抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，miR-551b mimics、miR-551b inhibitors、miR-551b無義序列、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，Trizol提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，引物購自上海生工生物工程股份有限公司，Hoechst33342染色液購自上海晶都生物技術(shù)有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen公司，Transwell小室購自美國Costar公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胃癌組織、正常胃組織miR-551b表達檢測液氮中取出胃癌組織和正常胃組織，充分研磨，加入Trizol(1 mL/100 mg)和150 μL氯仿充分混勻，15 000 r/min離心10 min；吸取上清液再加入200 μL異丙醇混勻，15 000 r/min離心10 min，上清液棄去，75%乙醇洗滌沉淀。取5 μg總RNA，采用Real-time PCR檢測miR-551b表達水平，引物委托上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5′-CTGAGCGACCCATACTTGG-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液7 μL，Taq DNA酶0.5 μL，dNTP 5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，雙蒸水補充至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，62℃ 40 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)后74℃延伸5 min。以U6作為內(nèi)參照，檢測組織miR-551b相對表達量。

1.3.2 SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染 取復(fù)蘇后的SGC-7901細胞株，置于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，用不含血清的培養(yǎng)液洗滌3次，再用培養(yǎng)液將細胞重懸于不含抗生素的完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞密度1×106個/孔，再轉(zhuǎn)入6孔板中培養(yǎng)。將細胞分為3組：陰性對照組(negative control，NC)：將5 μL miRNA無義序列、2 μL Lipofectamine2000加入至200 μL不含血清的培養(yǎng)液中混勻，靜置5 min直接加入至6孔板細胞中培養(yǎng)；miR-551b模擬物(miR-551b mimics)組：加入5 μL濃度為20 nmol/L的miR-551b mimics和2 μL Lipofectamine2000；miR-551b抑制物(miR-551b inhibitors)組：加入5 μL濃度為20 nmol/L的miR-551b inhibitors和2 μL Lipofectamine2000；轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)箱中以37℃培養(yǎng)5～6 h，再將培養(yǎng)液更換為含有胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.3 MTT法檢測各組腫瘤細胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的各組細胞以1.0×107個/L接種于96孔板中，分別于12、24、36、48、60、72 h向每孔加入10 μL、5 g/L MTT溶液，培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)液棄去，再向每孔中加入150 μL DMSO，充分振蕩，置于酶標儀上，測量570 nm處吸光度值。

1.3.4 Transwell法檢測各組細胞侵襲能力 將轉(zhuǎn)染的各組細胞用不含血清的培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1.0×109個/L，Transwell上室每孔植入150 μL細胞，下室加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，每組分別設(shè)置6個復(fù)孔，細胞培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)結(jié)束后將Transwell小室濾膜用4%多聚甲醛固定，輕輕拭去表面細胞；結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，于顯微鏡下觀察穿透濾膜的細胞數(shù)。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染24 h的細胞，5 000 r/min離心5 min，收集細胞；75%乙醇以4℃固定24 h，1 500 r/min離心5 min棄去乙醇，PBS沖洗；按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書對細胞進行處理，流式細胞儀分析結(jié)果。

1.3.6 Hoechst33342染色 取對數(shù)生長期細胞，分別接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，再加入0.5 mL固定液于4℃固定過夜；再加入1 mL Hoechst33342染色液染色10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 Western blot檢測各組細胞NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達 收集對數(shù)生長期細胞，加入100 μL含1%PMSF的細胞裂解液充分裂解，4℃15 000 r/min離心20 min，吸取上清液，將上清液移至EP管中，加入等量上樣液，100℃煮沸5 min，使蛋白完全變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，100 mA、40 min電轉(zhuǎn)后將PVDF膜取出。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1 000 NF-κB抗體、1∶1 000 LC3Ⅱ抗體、1∶500 Beclin 1抗體、1∶50 β-actin抗體，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，再按照1∶1 000加入二抗，室溫下振蕩孵育2 h，PBS沖洗3次。ECL顯色，凝膠成像分析儀采集圖像，測定目的蛋白灰度值，目的蛋白相對表達量為樣本條帶與β-actin條帶灰度值比值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、正常胃組織miR-551b表達

miR-551b在胃癌組織表達明顯下調(diào)，胃癌組織miR-551b相對表達量(1.75±0.13)顯著低于正常胃組織(2.47±0.38)(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-551b mimics和miR-551b inhibitors后各組細胞miR-551b表達

轉(zhuǎn)染24 h后，與NC組和miR-551b inhibitors組比較，miR-551b mimics組miR-551b表達水平顯著上升(均P<0.05)，與NC組比較，miR-551b inhibitors組miR-551b表達水平顯著降低(P<0.05)，說明miR-551b mimics能夠上調(diào)miR-551b表達，miR-551b inhibitors能夠下調(diào)miR-551b表達，見圖1。

與NC組比較，*P<0.05；與miR-551b mimics組比較，#P<0.05圖1 各組細胞miR-551b表達Fig.1 miR-551b expression level in each group

2.3 各組細胞增殖能力的變化

在24～72 h時間內(nèi)，miR-551b mimics組細胞增殖顯著低于NC組和miR-551b inhibitors組(均P<0.05)，見圖2。

與miR-551b inhibitors組比較，#P<0.05；與NC組比較，*P<0.05圖2 各組細胞增殖能力的變化Fig.2 Changes of proliferation ability in each cell group

2.4 各組細胞侵襲能力的變化

NC組、miR-551b mimics組、miR-551b inhibitors組細胞侵襲率分別為(52.01±2.01)%、(45.37±1.72)%、(94.47±3.07)%，與NC組和miR-551b inhibitors組比較，miR-551b mimics組細胞侵襲率顯著降低(均P<0.05)；與NC組比較，miR-551b inhibitors組細胞侵襲率顯著上升(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組細胞侵襲能力的變化(結(jié)晶紫染色，×200)Fig.3 Changes of invasion ability in each cell group(Crystal violet staining，×200)

2.5 各組細胞凋亡情況

NC組、miR-551b mimics組、miR-551b inhibitors組細胞凋亡率分別為(44.05±16.21)%、(72.31±22.79)%、(35.30±11.27)%，與NC組和miR-551b inhibitors組比較，miR-551b mimics組細胞凋亡率明顯上升(均P<0.05)；與NC組比較，miR-551b inhibitors組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖4。

2.6 各組細胞自噬形態(tài)變化

Hoechst33342熒光染色結(jié)果顯示，miR-551b mimics組出現(xiàn)大量自噬泡(亮藍色)，NC組可見部分自噬泡，而miR-551b inhibitors組僅有少量自噬泡，見圖5。

與miR-551b inhibitors組比較，#P<0.05；與NC組比較*P<0.05圖4 各組細胞凋亡情況Fig.4 Changes of cell apoptosis in each cell group

圖5 各組細胞自噬形態(tài)變化(Hoechst 33342染色，×400)Fig.5 Morphological changes of cell autophagy of each cell group(Hoechst 33342 staining，×400)

2.7 各組細胞NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達

與NC組和miR-551b inhibitors組比較，miR-551b mimics組NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)；與NC組比較，miR-551b inhibitors組NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，見圖6。

3 討論

miRNA[7-8]是一類近年來新發(fā)現(xiàn)的在轉(zhuǎn)錄翻譯水平調(diào)控靶基因蛋白表達的非編碼小RNA，雖然其分子小、數(shù)量少，但卻調(diào)控著大量基因的表達。目前已經(jīng)證實miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9]。在關(guān)于胃癌的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了部分miRNA，如miR-29a、miR-15a、miR-124、miR-551b等。溫馨等[10]報道，miR-551b在胃癌組織中表達異常，檢測miR-551b可以為診斷胃癌和預(yù)測病情提供參考。葉敏等[11]認為miR-551b可能是作為一個抑癌基因參與胃癌的進展，抑制miR-551b表達能夠明顯促進胃癌的進展。本研究對胃癌組織和正常胃組織miR-551b表達水平進行檢測，結(jié)果顯示miR-551b在胃癌組織表達明顯下調(diào)，胃癌組織miR-551b相對表達量顯著低于正常胃組織，說明miR-551b可能對胃癌的進展起到負調(diào)控作用。陳兆峰等[12]對40例胃癌和正常胃組織標本進行檢測，結(jié)果顯示miR-551b在胃癌組織表達降低，且表達水平與腫瘤體積、侵襲程度、轉(zhuǎn)移分期呈負相關(guān)，提示miR-551b可能作為抑癌因子參與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學過程。

與miR-551b inhibitors組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05圖6 各組細胞NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表達Fig.6 NF-κB，LC3Ⅱ，Beclin 1 protein expression in each cell group

既往研究證實，miRNA與腫瘤的增殖、耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移等細胞功能密切相關(guān)，如miR-124與胃癌進展有關(guān)，miR-15a可能參與調(diào)控胃癌的增殖和侵襲等[13-14]。本研究以人胃癌細胞株SGC-7901作為研究對象，分別將miR-551b mimics、miR-551b inhibitors和miR-551b無義序列轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞，經(jīng)過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-551b mimics能夠上調(diào)miR-551b表達，miR-551b inhibitors能夠下調(diào)miR-551b表達，證實轉(zhuǎn)染成功。進一步分析發(fā)現(xiàn)與NC組和miR-551b inhibitors組比較，miR-551b mimics組細胞細胞增殖率和侵襲率顯著降低，細胞凋亡率明顯上升，證實miR-551b在胃癌細胞功能中主要發(fā)揮抑癌作用。丁麗芳等[15]發(fā)現(xiàn)大腸癌組織miR-551b表達量顯著低于正常組織，并且miR-551b表達量與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。韋尉元等[16]將miR-551b mimics轉(zhuǎn)染至胃癌細胞，發(fā)現(xiàn)miR-551b能夠抑制胃癌細胞中靶基因PRL-3的蛋白表達，并進一步抑制胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。

自噬是在真核細胞中廣泛存在的降解和再循環(huán)系統(tǒng)，其主要過程是吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程。饑餓、氧化、壓力等應(yīng)激狀態(tài)均是自噬的誘導(dǎo)因素[17]，目前關(guān)于自噬的具體分子機制尚不明確，可能與細胞代謝失衡有關(guān)。實驗證實，化療、放療等治療因素能夠激活自噬活動，提高腫瘤細胞對環(huán)境刺激的適應(yīng)性[18]；但是過度自噬又可以誘導(dǎo)自噬性凋亡。鑒于自噬在細胞生長過程中的雙刃劍作用，對自噬相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子機制研究就顯得尤為重要。研究證實，miRNA可以調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的表達，從而調(diào)控腫瘤的病理過程[19]。本研究顯示，miR-551b mimics組出現(xiàn)大量自噬泡，NC組可見部分自噬泡，而miR-551b inhibitors組僅有少量自噬泡，并且miR-551b mimics組細胞膜結(jié)構(gòu)模糊不清，凋亡率增加，證實miR-551b可誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生自噬性凋亡。

NF-κB是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的核蛋白因子，NF-κB被激活后能夠參與腫瘤細胞程序性凋亡。Ho等[20]證實放療、化療等能夠誘導(dǎo)胃癌細胞NF-κB表達，促進細胞發(fā)生凋亡。LC3Ⅱ是定位于自噬泡內(nèi)膜的蛋白，激活LC3前體能夠形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ暴露的甘氨酸殘基能夠與自噬泡內(nèi)膜磷脂酰乙醇胺結(jié)合，并修飾為膜型(LC3Ⅱ)。因此LC3Ⅱ的含量能夠間接反映自噬泡的數(shù)量[21]。Beclin 1是調(diào)節(jié)細胞自噬的重要蛋白[22]，Beclin 1與相應(yīng)受體PI3K3C結(jié)合成Beclin 1/PI3K3C復(fù)合物后，能夠激活細胞自噬調(diào)節(jié)通路，參與調(diào)節(jié)細胞自噬過程。本研究顯示miR-551b mimics組凋亡蛋白NF-κB及自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ、Beclin 1表達水平均顯著升高，提示NF-κB可能通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)因子的表達，參與了胃癌細胞自噬性凋亡。

綜上所述，miR-551b能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲等細胞生物學特性，其作用機制可能是誘導(dǎo)了胃癌細胞發(fā)生自噬性凋亡，為胃癌的治療提供了新的作用靶點。

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(2016-10-27 收稿)

Expression of miR-551b in Human Gastric Carcinoma and Its Effect on Apoptosis of Human Gastric Carcinoma Cell Lines

Wang Ya’nan1，Wei Yaning2，Xv Fang1etal

1Department of Pathology，2Department of Medical Oncology，the Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China

Objective To explore miR-551b expression in human gastric carcinoma and effect of miR-551b on autophagic apoptosis of human gastric carcinoma cell lines.Methods The miR-551b expression in gastric cancer tissues and normal gastric tissues was detected by real-time PCR.miRNA nonsense sequences，miR-551b mimics，miR-551b inhibitors were transfected into human gastric carcinoma SGC-7901 cell lines，and miR-551b expression in the cells of each group was detected by real-time PCR.Proliferation activity of tumor cells was detected by MTT assay；invasion ability of tumor cells was detected by Transwell method；cell apoptosis was detected by flow cytometry；autophagy and apoptosis in each group was observed by Hoechst33342 fluorescence staining；protein expression of NF-κB，LC3Ⅱ and Beclin 1 was detected by Western blotting.Results The expression of miR-551b in gastric carcinoma was significantly down-regulated，and the relative expression of miR-551b(1.75±0.13)in gastric carcinoma was significantly lower than that in normal gastric tissue(2.47±0.38)(P<0.05).Compared with NC group and miR-551b inhibitors group，miR-551b expression level in miR-551b mimics group was significantly increased，proliferation rate and invasion rate were significantly decreased，apoptosis rate significantly increased(allP<0.05).Hoechst33342 fluorescence staining showed that large number of autophagy bubbles appeared in miR-551b mimics group，some autophagy bubbles in NC group，and only a small number of autophagy bubbles in miR-551b inhibitors group.Western blotting showed that，as compared with NC group and miR-551b inhibitors group，expression levels of NF-κB，LC3Ⅱ and Beclin 1 in miR-551b mimics group were significantly increased(P<0.05).Conclusion MiR-551b can inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cells，and the action mechanism may be related to inducing the autophagic apoptosis of gastric cancer cells.

micro RNA； gastric cancer； invasion； apoptosis； proliferation； autophagy apoptosis

*國家自然科學基金資助項目(No.81672706)

R735.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.004

王婭南，女，1978年生，副主任醫(yī)師，E-mail：wangyanan1610@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：zhangjinku_001@163.com