劉平賢，張浩，李鹍鵬

（河南省南陽市中心醫(yī)院 乳腺外科，河南 南陽 473009）

微小核糖核酸101異常表達(dá)與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的關(guān)系

劉平賢，張浩，李鹍鵬

（河南省南陽市中心醫(yī)院 乳腺外科，河南 南陽 473009）

目的探討微小核糖核酸101（miRNA-101）在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)及其對MDAMB-231細(xì)胞增殖的影響。方法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中miRNA-101的表達(dá)。采用LipofectamineTM2000將miRNA-101-mimic/ inhibitor/NC分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，通過qRT-PCR檢測miRNA-101的轉(zhuǎn)染效率，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。結(jié)果miRNA-101在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常乳腺細(xì)胞MCF-10a（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染miRNA-101 mimic后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力減弱（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miRNA-101 inhibitor后細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)論miRNA-101在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miRNA-101 mimic后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖減弱。

乳腺癌；MDA-MB-231；miRNA-101；增殖

微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）是內(nèi)源性非編碼短鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲和遷移等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，最終可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1-2]。有研究表明，miRNA-101在前列腺癌、膀胱癌等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)并與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。研究報(bào)道，miRNA-101可通過調(diào)控COX-2的表達(dá)從而抑制肺癌和宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[4-5]。在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)異常，但miRNA-101在乳腺癌中的表達(dá)及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制研究尚少[6]。本研究擬采用乳腺癌MDA-MB-231、正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞，觀察miRNA-101在兩者中表達(dá)的差異并探討其對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 MDA-MB-231為人乳腺癌細(xì)胞株，MCF-10A為人正常乳腺上皮細(xì)胞，作為正常組[7]，兩細(xì)胞株均由本實(shí)驗(yàn)室購于美國模式培養(yǎng)物儲(chǔ)存庫（ATCC），用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基（購自美國Gibco公司），胎牛血清（購自上海依科賽公司），Trizol試劑、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（購自日本TaKaRa公司），miRNA-101引物（上海生工生物工程有限公司合成），轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM（購自美國Invitrogen公司），miRNA-101 mimic、miRNA-101 inhibitor及miRNA NC（合成自美國Invitrogen公司），CCK-8試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)研究所），6孔板、96孔板和細(xì)胞培養(yǎng)皿（購自美國Corning公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（購自美國Thermo公司），PCR儀（BS97MyCycler）（購自美國BIO-RAD公司），qRT-PCR（ABI-7500）儀（購自美國ABI公司），倒置顯微鏡（TS100-F）（購自日本尼康公司），酶標(biāo)儀（Multiskan Ascent）（購自美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測miRNA-101在正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá) 將MCF-10A和MDA-MB-231細(xì)胞分別按照1.0×105～1.5×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種6孔板，48 h后分別收集細(xì)胞，PBS洗滌，12 000r/min離心5min后，加入0.5ml Trizol。按照miRNA分離提取試劑盒所提供的步驟提取miRNA。用紫外分光光度計(jì)測定所提取RNA的濃度及純度，之后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：25℃保持30min，再42℃保持30min，最后85℃保持5min。以cDNA為模板，按照qRT-PCR劑盒提供的步驟加入相關(guān)試劑及miRNA-101引物（見表1），以U6為內(nèi)參（見表1），在ABI-7500實(shí)時(shí)熒光定量儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：先95℃下保持3min，然后做40次循環(huán)；每次循環(huán)為95℃保持12 s，再62℃保持40 s。

表1 qRT-PCR的引物

1.2.2 miRNA轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細(xì)胞按照1.0×105～1.5×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種6孔板，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24h，細(xì)胞融合率為30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染miRNA-101 mimic、miRNA-101inhibitor及miRNA NC，序列分別如下：miRNA-101 mimic：5'-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'，miRNA-101 inhibitor：5'-UUCAGUUAUCACAGUAC UGUA-3'，miRNA NC：5'-UCACAACCUCCUAGAAA GAGUAGA-3'。按照LipofectamineTM2000使用說明書瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，分別收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miRNA-101的表達(dá)水平，操作方法按照1.2.1。

1.2.3 CCK-8法檢測miRNA-101過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231活力的影響 將MDA-MB-231細(xì)胞以2×103個(gè)/孔細(xì)胞，加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分別轉(zhuǎn)染miRNA-101 mimic、miRNA-101 inhibitor及miRNA NC，并設(shè)置MDA-MB-231空白轉(zhuǎn)染組，每組6個(gè)復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72及96 h加入10μl CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。選擇450 nm波長，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值（OD），另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基不加入MDA-MB-231細(xì)胞作為空白對照。細(xì)胞活力×（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100%，其中A（加藥）為具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液孔的吸光度，A（空白）為具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細(xì)胞孔的吸光度，A（0加藥）為具有細(xì)胞、CCK溶液而沒有藥物溶液孔的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，均行正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間采用單因素方差分析（one way ANOVA），多時(shí)點(diǎn)觀測資料則行重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析；兩組間的比較用t檢驗(yàn)（Student's t test）或LSD-t檢驗(yàn)，時(shí)間比較為調(diào)整顯著性水準(zhǔn)后的差值t檢驗(yàn)；此外相關(guān)性分析用非參數(shù)相關(guān)性Spearman檢驗(yàn)；時(shí)間比較的顯著性水準(zhǔn)α’按Bonferroni校正法調(diào)整，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-101在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)

miRNA-101在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)相對值為（0.61±0.09），正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10a中的相對表達(dá)值為（1.00±0.01），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.550，P=0.000）。

2.2 miRNA-101 mimic及miRNA-101 inhibitor成功轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞

miRNA-101轉(zhuǎn)染后，各組miRNA-101的表達(dá)相對值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 746.649，P=0.000）。mimic組細(xì)胞內(nèi)miRNA-101的表達(dá)相對值為（6.03±0.31），與miRNA NC組細(xì)胞內(nèi)miRNA-101的表達(dá)相對值（1.00±0.00）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；miRNA-101 inhibitor轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)miRNA-101的表達(dá)相對值為（0.45±0.05），與miRNA NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 miRNA-101對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

在miRNA-101-mimic/inhibitor/NC轉(zhuǎn)染MDAMB-231細(xì)胞后，分別于24、48、72及96 h時(shí)檢測細(xì)胞增殖活力。經(jīng)多因素重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①不同時(shí)間的細(xì)胞活力有差異（F=2193.131，P=0.000）；②組間細(xì)胞活力有差異（F=449.528，P=0.000），過表達(dá)miRNA-101后，MDA-MB-231的細(xì)胞增殖活力低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而沉默miRNA-101后，MDA-MB-231的細(xì)胞增殖活力高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而miRNA NC與空白對照組（Con組）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③實(shí)驗(yàn)組與對照組的細(xì)胞活力變化趨勢有差異（F=150.024，P=0.000），miRNA-101可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖。見表2和附圖。

表2 miRNA-101對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響 （n=6，%，±s）

表2 miRNA-101對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響 （n=6，%，±s）

組別96 h Con組 8.49±0.88 52.79±5.34 93.57±8.16 111.85±10.18 miRAN NC組 10.43±0.77 53.50±5.59 95.53±7.47 119.47±10.27 mimic組 3.24±0.25 20.22±0.57 45.15±2.25 66.21±5.31 inhibitor組 35.18±2.77 101.45±8.00 190.33±11.20 244.13±14.3124 h48 h72 h

附圖 表達(dá)miRNA-101抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖能力

3 討論

乳腺癌是目前女性最常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是常見的女性惡性腫瘤患者第6位死亡原因[8]。分子靶向治療是近年來新興的治療手段，尋找有效的治療靶點(diǎn)是其研究的熱點(diǎn)，而miRNA的出現(xiàn)為研究乳腺癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)[3，9]。

miRNA-101是哺乳動(dòng)物常見序列之一，在多種細(xì)胞中檢測到miRNA-101存在。人類miRNA-101包含2種前體RNA：miRNA-101-1和miRNA-101-2；其長度分別為75和79 bp，成熟miRNA-101含21個(gè)堿基對。miRNA庫中（http：//mirbase.org）顯示其可與EZH2及MYCN基因特異性結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，與前者結(jié)合力較強(qiáng)。大量研究表明，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，miRNA-101可抑制細(xì)胞分裂增殖，并在凋亡調(diào)控中起重要作用，其在功能上表現(xiàn)為抑癌基因特性[10-12]。

目前在前列腺癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)miRNA-101表達(dá)下調(diào)，對EZH2基因具有負(fù)調(diào)控作用[13]；在大腸癌細(xì)胞中，miRNA-101通過下調(diào)SphK1的表達(dá)從而抑制大腸癌細(xì)胞的生長[14]，說明miRNA-101與體外腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤、克隆形成和發(fā)生腫瘤密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)miRNA-101在MDA-MB-231細(xì)胞中低表達(dá)。采用CKK-8法測定細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-101表達(dá)，隨時(shí)間推移，呈抑制乳腺癌細(xì)胞增殖趨勢，下調(diào)miRNA-101表達(dá)，隨時(shí)間推移，乳腺癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。表明miRNA-101可抑制乳腺癌細(xì)胞分裂增殖，在功能上表現(xiàn)為抑癌基因特性。

在前列腺癌、乳腺癌及膀胱癌等腫瘤中，miRNA-101通常靶向作用于EZH2基因的3'-端非翻譯區(qū)。miRNA通常在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因調(diào)控，與靶基因的mRNA的3'-端的非翻譯區(qū)以堿基配對的方式來執(zhí)行對靶基因的切割或者翻譯的抑制功能，從而實(shí)現(xiàn)自身的功能。然而在乳腺癌中，miRNA-101的靶基因的確定需要進(jìn)一步研究。

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Preliminary study of correlation between abnormally expressed miRNA-101 and proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells

Ping-xian Liu,Hao Zhang,Kun-peng Li
(Department of Breast Surgery,Nanyang Central Hospital,Nanyang,Henan 473009,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miRNA-101 and its effect on the proliferation ability in breast cancer MDA-MB-231 cells.MethodsqRT-PCR was used to detect the expression of miRNA-101 in breast cancer MDA-MB-231 cells and normal mammary epithelial MCF-10A cells.miRNA-101-mimic/inhibitor/NC were transfected into MDA-MB-231 cells by LipofectamineTM2000.qRT-PCR was used to detect the transfection efficiency.CCK-8 assay was used to evaluate the proliferation ability of MDAMB-231 cells after the transfection.ResultsThe expression of miRNA-101 in MDA-MB-231 cells was significantly lower than that in MCF-10a cells (P＜0.05).The proliferation ability of MDA-MB-231 cells was significantly decreased after transfection with miRNA-101 mimic (P＜0.05),while the proliferation ability was significantly increased after transfection with miRNA-101 inhibitor (P＜0.05).ConclusionsmiRNA-101 is down-regulated in MDA-MB-231 cells.The proliferation ability of breast cancer MDA-MB-231 cells is inhibited after transfection with miRNA-101-mimic.

breast cancer;MDA-MB-231;miRNA-101;proliferation

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.009

1005-8982（2017）18-0047-04

2016-05-09