王雪純，張鳳芹

（1.河北醫(yī)科大學(xué)口腔學(xué)院，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院 病理科，河北 衡水 053000）

新進(jìn)展研究·論著

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1和2基因在幽門(mén)螺桿菌相關(guān)胃癌中的表達(dá)及意義

王雪純1，張鳳芹2

（1.河北醫(yī)科大學(xué)口腔學(xué)院，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院 病理科，河北 衡水 053000）

目的探討核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）1和2基因在幽門(mén)螺桿菌（Hp）相關(guān)胃癌患者中的表達(dá)變化及意義。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌患者癌組織中NOD1和NOD2蛋白的表達(dá)；采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）檢測(cè)胃癌組織中NOD1和NOD2 mRNA的表達(dá)；采用Western blot檢測(cè)胃癌組織中凋亡蛋白核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）表達(dá)。結(jié)果與Hp陰性胃癌患者相比，Hp陽(yáng)性胃癌患者癌組織中的NOD1和NOD2蛋白表達(dá)含量和mRNA表達(dá)含量上升；Hp陽(yáng)性胃癌患者中的NF-κB和Caspase-3蛋白含量升高（P＜0.05）。結(jié)論Hp陽(yáng)性胃癌患者中的NOD1和NOD2呈高表達(dá)狀態(tài)；且過(guò)表達(dá)NOD1和NOD2可能在Hp陽(yáng)性胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中起重要的作用。

幽門(mén)螺桿菌；胃癌；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域；凋亡；免疫組織化學(xué)

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率與病死率逐漸上升[1-2]。胃癌的的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要是飲食、生活習(xí)慣、環(huán)境和遺傳等因素共同作用的結(jié)果[3]。研究表明，幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染、營(yíng)養(yǎng)素缺乏、N-亞硝基化合物及飲酒吸煙均是胃癌發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素[4-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，幽門(mén)螺桿菌感染不僅取決于其菌株的多樣性，而且與感染機(jī)體的遺傳易感性相關(guān)[6-7]。先天免疫系統(tǒng)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerzation do-main，NOD）1和2蛋白作為蛋白家族中2個(gè)重要的成員，通過(guò)識(shí)別和清除外源性病原微生物、介導(dǎo)天然免疫，是抵御Hp感染的第一道防線[8-9]。NOD1和NOD2的免疫調(diào)節(jié)作用可能參與Hp相關(guān)胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，為研究NOD1和NOD2在Hp相關(guān)胃癌發(fā)病中的作用，本研究采用免疫組織化學(xué)（SP法）及實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）檢測(cè)患者活檢標(biāo)本中NOD1和NOD2的表達(dá)，探討NOD1和NOD2在幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性胃癌組織中的的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本

選取2015年3月-2017年1月河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵(lì)遜臨床醫(yī)院外科收集的90例Hp陽(yáng)性的胃癌患者組織學(xué)標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，均經(jīng)組織病理學(xué)確診。其中，男性49例，女性41例；年齡25～72歲，平均53歲。經(jīng)快速尿素酶試驗(yàn)和13C尿素呼氣試驗(yàn)均證實(shí)患者Hp陽(yáng)性。同時(shí)，取30例Hp陰性胃癌患者的組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠抗人NOD1、NOD2、肌動(dòng)蛋白（β-actin）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）及天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）單克隆抗體（均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司），二抗堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、DAB染色盒、抗體稀釋液及中性樹(shù)脂（均購(gòu)于北京中杉金橋有限公司），real-time PCR試劑盒（購(gòu)自日本TaKaRa公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NOD1和NOD2的蛋白表達(dá)水平 取120例患者的胃癌病理石蠟標(biāo)本（Hp陽(yáng)性90例，Hp陰性30例），分別連續(xù)切片5張（5 μm/張）。用5%血清進(jìn)行室溫封閉40min后，分別加入1∶1 000的NOD1和NOD2單克隆抗體孵育，4℃過(guò)夜。隔天復(fù)溫后，加入二抗孵育37℃ 30min，PBS清洗后加入SP后進(jìn)行恒溫反應(yīng)40min，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，中性樹(shù)膠封片后用（×10）（× 40）顯微鏡進(jìn)行觀察。陽(yáng)性表達(dá)NOD1和NOD2的主要表現(xiàn)是棕黃色顆粒在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)。隨機(jī)選擇6個(gè)（×40）顯微鏡下的高倍視野，計(jì)算反應(yīng)組織中NOD1和NOD2蛋白的表達(dá)含量的平均光密度（mean optical density，MOD）。MOD=累積光密度（IOD）與面積（area）的比值，即MOD=（IOD SUM）/area。

1.3.2Real-time PCR檢測(cè)NOD1和NOD2 mRNA表達(dá)含量 采用real-time PCR對(duì)NOD1和NOD2 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Trizol提取胃癌組織中的總RNA，用TaKaRa公司的Prime Script RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行real-time PCR操作。實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)定量法，采取循閾值（cycle threshold，Ct）比較法，計(jì)算不同樣本之間的相對(duì)百分比。NOD1正向引物：5'-ACAAC AGGCGAACTATCTGCGTCA-3'；反向引物：5'-TCTT AACCGGAAGTAGGCGGAAG-3'。NOD2正向引物：5'-CCGTGTCCTGTTAACCTTTG-3'；反向引物：5'-AG GATCAGCAGGTACATGTC-3'。β-actin正向引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；反向引物：5'-T CCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。公式：ΔΔCt=（Ct實(shí)驗(yàn)組的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組管家基因）-（Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組管家基因）；目的mRNA的量=2-ΔΔCt。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡蛋白Caspase-3和NF-κB 取組織冰上裂解2h，離心后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg/μl。將各組蛋白樣品加入到10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后按1∶1000的稀釋比例加入一抗和二抗。用ECL顯色劑顯色，用Bio-Pro凝膠成像分析儀成像以及用Quantityone軟件對(duì)各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD1和NOD2免疫組織化學(xué)結(jié)果

Hp陰性胃癌組織和Hp陽(yáng)性胃癌組織中的NOD1蛋白免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度有差異（P＜0.05），Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1呈高表達(dá)水平。Hp陰性胃癌和Hp陽(yáng)性胃癌組織中的NOD2蛋白免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD2呈高表達(dá)水平。見(jiàn)圖1、2。

圖1 NOD1的蛋白表達(dá)含量

圖2 NOD2的蛋白表達(dá)含量

2.2 NOD1和NOD2的蛋白表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)光密度的結(jié)果，其中，Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1蛋白表達(dá)含量為（1.823± 0.042），Hp陰性胃癌組織中為（0.794±0.041），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=78.40，P=0.000），與Hp陰性胃癌組織中的蛋白表達(dá)量比較，Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1的蛋白表達(dá)量增加56.45%。Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD2蛋白表達(dá)含量為（1.337±0.035），Hp陰性胃癌組織中為（0.645±0.035），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=62.52，P=0.000），與Hp陰性胃癌組織中的蛋白表達(dá)量比較，Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1的蛋白表達(dá)量增加51.76%。

2.3 NOD1和NOD2 mRNA表達(dá)含量

Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1 mRNA表達(dá)含量（1.511±0.062），Hp陰性胃癌組織NOD1 mRNA表達(dá)含量（1.00±0.040），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.010，P=0.000），Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1 mRNA表達(dá)含量升高。Hp陰性胃癌組織NOD2 mRNA表達(dá)含量（1.00±0.037），Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD2 mRNA表達(dá)含量（1.282±0.043），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.300，P=0.000），Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD2 mRNA表達(dá)含升高量。

2.4 NF-κB和Caspase-3蛋白含量

Hp陰性胃癌組織NF-κB蛋白表達(dá)（0.641± 0.030），Hp陽(yáng)性胃癌組織中的NF-κB蛋白表達(dá)（1.083±0.061），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.330，P=0.000），Hp陽(yáng)性胃癌組織中NF-κB表達(dá)升高；Hp陰性胃癌組織 Caspase-3蛋白表達(dá)（0.593±0.019），Hp陽(yáng)性胃癌組織中的Hp陽(yáng)性胃癌組織中的Caspase-3蛋白表達(dá)（0.857±0.037），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.000，P=0.000），Hp陽(yáng)性胃癌組織中的Caspase-3蛋白表達(dá)升高。見(jiàn)圖3。

圖3 NF-kB和Caspase-3蛋白含量

3 討論

Hp胃癌是人類健康與生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]，研究表明，Hp的菌株的多樣性和機(jī)體的遺傳易感性均是與胃癌發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素[10-11]。機(jī)體抵御外來(lái)病原生物入侵的第一道防線是先天固有免疫系統(tǒng)。NOD1和NOD2作為在遺傳上高度保守的NOD蛋白質(zhì)家族成員，廣泛存在于植物、動(dòng)物和人體細(xì)胞內(nèi)[12-13]。可通過(guò)識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞外壁中的肽聚糖和脂多糖，依靠蛋白激酶間的相互作用，激活和活化絲裂原活化蛋白激酶及NF-κB信號(hào)通路，使外源性病原微生物細(xì)胞內(nèi)的DNA破裂降解而逐漸清除[14-15]。其中，NF-κB作為一種多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，在炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞增殖等生理病理過(guò)程中發(fā)揮作用，激活后可密切參與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞凋亡的過(guò)程，這最終導(dǎo)致效應(yīng)性Caspase-3活化，胞核內(nèi)DNA鏈斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體細(xì)胞死亡發(fā)生[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，與Hp陰性胃癌組織相比，Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1和NOD2的蛋白表達(dá)含量均上升，差異明顯；對(duì)NOD1和NOD2進(jìn)行基因水平檢測(cè)顯示，與Hp陰性胃癌組織比較，Hp陽(yáng)性胃癌組織中NOD1和NOD2 mRNA表達(dá)含量均升高，有明顯差異。結(jié)果表明，NOD1和NOD2在抵御Hp感染及Hp相關(guān)胃癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的抑制作用。Hp相關(guān)胃癌組織中NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活，NOD1和NOD2高表達(dá)抑制Hp相關(guān)胃癌的細(xì)胞的增殖過(guò)程，同時(shí)使凋亡相關(guān)基因 Caspase-3活性升高，加速細(xì)胞凋亡的過(guò)程。結(jié)果說(shuō)明NOD1和NOD2的特異性高表達(dá)可能加速細(xì)胞凋亡的過(guò)程，促進(jìn)Hp相關(guān)胃癌細(xì)胞的凋亡發(fā)生。

綜上所述，NOD1和NOD2在Hp相關(guān)胃癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定的抑制作用，通過(guò)調(diào)控自身免疫系統(tǒng)來(lái)加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但NOD1和NOD2在Hp相關(guān)胃癌中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。在正常人群中，胃黏膜細(xì)胞中的NOD1和NOD2的異常表達(dá)可能提示幽門(mén)螺桿菌感染及Hp相關(guān)胃癌的發(fā)生，聯(lián)合檢測(cè)NF-κB的蛋白表達(dá)含量有助于Hp陽(yáng)性胃癌的診斷，為臨床治療提供有效的幫助。

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Expression and significance of nucleotide binding oligomerization domains 1 and 2 inHelicobacter pylori-associated gastric cancer

Xue-chun Wang1,Feng-qin Zhang2
(1.School of Stomatology,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050011,China; 2.Department of Pathology,Harrison International Peace Hospital Affiliated Hebei Medical University,Hengshui,Hebei 053000,China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of NOD1 and NOD2 in patients with Helicobacter pylori (Hp)associated gastric cancer.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of NOD1 and NOD2 proteins in patients withHp-associated gastric cancer.The expression of NOD1 and NOD2 mRNA was detected by real-time PCR.Western blot was used to detect the expression of NF-κB and Caspase-3.ResultsCompared with the control group (patients withHp-negative gastric cancer), the expression of NOD1 and NOD2 protein and mRNA in the patients withHp-positive gastric cancer increased significantly,the levels of NF-κB and Caspase-3 in theHp-positive gastric cancer patients were increased (P＜0.05).ConclusionsCompared with theHp-negative gastric cancer,NOD1 and NOD2 are highly expressed in the patients withHp-associated gastric cancer.And NOD1 and NOD2 over-expressions may play important roles in the development and progression ofHp-associated gastric cancer.

Helicobacter pylori;gastric cancer;NOD;apoptosis;immunohistochemistry

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.008

1005-8982（2017）18-0043-04

2017-03-30