王雪純，張鳳芹

（1.河北醫(yī)科大學口腔學院，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學附屬哈勵遜國際和平醫(yī)院 病理科，河北 衡水 053000）

新進展研究·論著

核苷酸結合寡聚化結構域1和2基因在幽門螺桿菌相關胃癌中的表達及意義

王雪純1，張鳳芹2

（1.河北醫(yī)科大學口腔學院，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學附屬哈勵遜國際和平醫(yī)院 病理科，河北 衡水 053000）

目的探討核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）1和2基因在幽門螺桿菌（Hp）相關胃癌患者中的表達變化及意義。方法采用免疫組織化學法檢測胃癌患者癌組織中NOD1和NOD2蛋白的表達；采用實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）檢測胃癌組織中NOD1和NOD2 mRNA的表達；采用Western blot檢測胃癌組織中凋亡蛋白核轉錄因子κB（NF-κB）和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）表達。結果與Hp陰性胃癌患者相比，Hp陽性胃癌患者癌組織中的NOD1和NOD2蛋白表達含量和mRNA表達含量上升；Hp陽性胃癌患者中的NF-κB和Caspase-3蛋白含量升高（P＜0.05）。結論Hp陽性胃癌患者中的NOD1和NOD2呈高表達狀態(tài)；且過表達NOD1和NOD2可能在Hp陽性胃癌發(fā)生、發(fā)展機制中起重要的作用。

幽門螺桿菌；胃癌；核苷酸結合寡聚化結構域；凋亡；免疫組織化學

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率與病死率逐漸上升[1-2]。胃癌的的病因及發(fā)病機制尚不明確，主要是飲食、生活習慣、環(huán)境和遺傳等因素共同作用的結果[3]。研究表明，幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染、營養(yǎng)素缺乏、N-亞硝基化合物及飲酒吸煙均是胃癌發(fā)病的主要危險因素[4-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染不僅取決于其菌株的多樣性，而且與感染機體的遺傳易感性相關[6-7]。先天免疫系統(tǒng)核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerzation do-main，NOD）1和2蛋白作為蛋白家族中2個重要的成員，通過識別和清除外源性病原微生物、介導天然免疫，是抵御Hp感染的第一道防線[8-9]。NOD1和NOD2的免疫調(diào)節(jié)作用可能參與Hp相關胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，為研究NOD1和NOD2在Hp相關胃癌發(fā)病中的作用，本研究采用免疫組織化學（SP法）及實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）檢測患者活檢標本中NOD1和NOD2的表達，探討NOD1和NOD2在幽門螺桿菌陽性胃癌組織中的的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 標本

選取2015年3月-2017年1月河北醫(yī)科大學附屬哈勵遜臨床醫(yī)院外科收集的90例Hp陽性的胃癌患者組織學標本為實驗組，均經(jīng)組織病理學確診。其中，男性49例，女性41例；年齡25～72歲，平均53歲。經(jīng)快速尿素酶試驗和13C尿素呼氣試驗均證實患者Hp陽性。同時，取30例Hp陰性胃癌患者的組織標本作為對照組。

1.2 實驗材料

小鼠抗人NOD1、NOD2、肌動蛋白（β-actin）、核轉錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）及天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）單克隆抗體（均購于美國Santa Cruz公司），二抗堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG、DAB染色盒、抗體稀釋液及中性樹脂（均購于北京中杉金橋有限公司），real-time PCR試劑盒（購自日本TaKaRa公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測NOD1和NOD2的蛋白表達水平 取120例患者的胃癌病理石蠟標本（Hp陽性90例，Hp陰性30例），分別連續(xù)切片5張（5 μm/張）。用5%血清進行室溫封閉40min后，分別加入1∶1 000的NOD1和NOD2單克隆抗體孵育，4℃過夜。隔天復溫后，加入二抗孵育37℃ 30min，PBS清洗后加入SP后進行恒溫反應40min，加入DAB顯色液進行顯色，中性樹膠封片后用（×10）（× 40）顯微鏡進行觀察。陽性表達NOD1和NOD2的主要表現(xiàn)是棕黃色顆粒在細胞內(nèi)出現(xiàn)。隨機選擇6個（×40）顯微鏡下的高倍視野，計算反應組織中NOD1和NOD2蛋白的表達含量的平均光密度（mean optical density，MOD）。MOD=累積光密度（IOD）與面積（area）的比值，即MOD=（IOD SUM）/area。

1.3.2Real-time PCR檢測NOD1和NOD2 mRNA表達含量 采用real-time PCR對NOD1和NOD2 mRNA表達進行檢測。Trizol提取胃癌組織中的總RNA，用TaKaRa公司的Prime Script RT試劑盒逆轉錄合成cDNA后，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行real-time PCR操作。實驗采用相對定量法，采取循閾值（cycle threshold，Ct）比較法，計算不同樣本之間的相對百分比。NOD1正向引物：5'-ACAAC AGGCGAACTATCTGCGTCA-3'；反向引物：5'-TCTT AACCGGAAGTAGGCGGAAG-3'。NOD2正向引物：5'-CCGTGTCCTGTTAACCTTTG-3'；反向引物：5'-AG GATCAGCAGGTACATGTC-3'。β-actin正向引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；反向引物：5'-T CCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。公式：ΔΔCt=（Ct實驗組的基因-Ct實驗組管家基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組管家基因）；目的mRNA的量=2-ΔΔCt。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡蛋白Caspase-3和NF-κB 取組織冰上裂解2h，離心后用BCA試劑盒進行蛋白濃度檢測，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg/μl。將各組蛋白樣品加入到10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，轉膜至PVDF膜后按1∶1000的稀釋比例加入一抗和二抗。用ECL顯色劑顯色，用Bio-Pro凝膠成像分析儀成像以及用Quantityone軟件對各泳道條帶進行灰度掃描得出相應蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NOD1和NOD2免疫組織化學結果

Hp陰性胃癌組織和Hp陽性胃癌組織中的NOD1蛋白免疫組織化學染色強度有差異（P＜0.05），Hp陽性胃癌組織中NOD1呈高表達水平。Hp陰性胃癌和Hp陽性胃癌組織中的NOD2蛋白免疫組織化學染色強度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Hp陽性胃癌組織中NOD2呈高表達水平。見圖1、2。

圖1 NOD1的蛋白表達含量

圖2 NOD2的蛋白表達含量

2.2 NOD1和NOD2的蛋白表達水平

免疫組織化學法檢測光密度的結果，其中，Hp陽性胃癌組織中NOD1蛋白表達含量為（1.823± 0.042），Hp陰性胃癌組織中為（0.794±0.041），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=78.40，P=0.000），與Hp陰性胃癌組織中的蛋白表達量比較，Hp陽性胃癌組織中NOD1的蛋白表達量增加56.45%。Hp陽性胃癌組織中NOD2蛋白表達含量為（1.337±0.035），Hp陰性胃癌組織中為（0.645±0.035），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=62.52，P=0.000），與Hp陰性胃癌組織中的蛋白表達量比較，Hp陽性胃癌組織中NOD1的蛋白表達量增加51.76%。

2.3 NOD1和NOD2 mRNA表達含量

Hp陽性胃癌組織中NOD1 mRNA表達含量（1.511±0.062），Hp陰性胃癌組織NOD1 mRNA表達含量（1.00±0.040），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=38.010，P=0.000），Hp陽性胃癌組織中NOD1 mRNA表達含量升高。Hp陰性胃癌組織NOD2 mRNA表達含量（1.00±0.037），Hp陽性胃癌組織中NOD2 mRNA表達含量（1.282±0.043），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=31.300，P=0.000），Hp陽性胃癌組織中NOD2 mRNA表達含升高量。

2.4 NF-κB和Caspase-3蛋白含量

Hp陰性胃癌組織NF-κB蛋白表達（0.641± 0.030），Hp陽性胃癌組織中的NF-κB蛋白表達（1.083±0.061），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=29.330，P=0.000），Hp陽性胃癌組織中NF-κB表達升高；Hp陰性胃癌組織 Caspase-3蛋白表達（0.593±0.019），Hp陽性胃癌組織中的Hp陽性胃癌組織中的Caspase-3蛋白表達（0.857±0.037），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=33.000，P=0.000），Hp陽性胃癌組織中的Caspase-3蛋白表達升高。見圖3。

圖3 NF-kB和Caspase-3蛋白含量

3 討論

Hp胃癌是人類健康與生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]，研究表明，Hp的菌株的多樣性和機體的遺傳易感性均是與胃癌發(fā)病的主要危險因素[10-11]。機體抵御外來病原生物入侵的第一道防線是先天固有免疫系統(tǒng)。NOD1和NOD2作為在遺傳上高度保守的NOD蛋白質(zhì)家族成員，廣泛存在于植物、動物和人體細胞內(nèi)[12-13]?？赏ㄟ^識別細菌細胞外壁中的肽聚糖和脂多糖，依靠蛋白激酶間的相互作用，激活和活化絲裂原活化蛋白激酶及NF-κB信號通路，使外源性病原微生物細胞內(nèi)的DNA破裂降解而逐漸清除[14-15]。其中，NF-κB作為一種多向轉錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，在炎癥、氧化應激及細胞增殖等生理病理過程中發(fā)揮作用，激活后可密切參與凋亡基因的轉錄調(diào)控及細胞凋亡的過程，這最終導致效應性Caspase-3活化，胞核內(nèi)DNA鏈斷裂，細胞結構的全面解體細胞死亡發(fā)生[16-17]。

本研究結果顯示，與Hp陰性胃癌組織相比，Hp陽性胃癌組織中NOD1和NOD2的蛋白表達含量均上升，差異明顯；對NOD1和NOD2進行基因水平檢測顯示，與Hp陰性胃癌組織比較，Hp陽性胃癌組織中NOD1和NOD2 mRNA表達含量均升高，有明顯差異。結果表明，NOD1和NOD2在抵御Hp感染及Hp相關胃癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要的抑制作用。Hp相關胃癌組織中NF-κB信號通路過度激活，NOD1和NOD2高表達抑制Hp相關胃癌的細胞的增殖過程，同時使凋亡相關基因 Caspase-3活性升高，加速細胞凋亡的過程。結果說明NOD1和NOD2的特異性高表達可能加速細胞凋亡的過程，促進Hp相關胃癌細胞的凋亡發(fā)生。

綜上所述，NOD1和NOD2在Hp相關胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮一定的抑制作用，通過調(diào)控自身免疫系統(tǒng)來加速細胞凋亡的發(fā)生，但NOD1和NOD2在Hp相關胃癌中的具體作用機制還需進一步研究。在正常人群中，胃黏膜細胞中的NOD1和NOD2的異常表達可能提示幽門螺桿菌感染及Hp相關胃癌的發(fā)生，聯(lián)合檢測NF-κB的蛋白表達含量有助于Hp陽性胃癌的診斷，為臨床治療提供有效的幫助。

[1]周衍,肖景榕,應敏剛,等.胃癌高、低發(fā)區(qū)飲用水中化學元素、硝酸鹽及亞硝酸鹽含量調(diào)查[J].中華疾病控制雜志,2009,13(5):619-620.

[2]路滟,徐耀初,沈洪兵.NOD1和NOD2基因多態(tài)性與胃癌遺傳易感性的研究[J].中華疾病控制雜志,2011,15(9):735-739.

[3]YANG L.Incidence and mortality of gastric cancer in China[J]. World J Gastroenterol,2006,12(1):17-20.

[4]胡立民.幽門螺桿菌的致病機制[J].臨床軍醫(yī)雜志,2004,32(6): 117-118.

[5]李唯瓊,張超.幽門螺桿菌與胃癌相關性探討[J].當代醫(yī)學,2010, 16(32):41-42.

[6]STADTL-NDER C T,WATERBOR J W.Molecular epidemiology, patho-genesis and prevention of gastric cancer[J].Carcinogenesis, 1999,20(12):2195-2208.

[7]JORDENS J,JANSSENS V,LONGIN S,et al.The protein phosphatase 2A phosphataseactivator is a novel peptidyl-prolyl cis/trans-isomerase[J].J Biol Chem,2006,281(10):6349-6357.

[8]ROSENSTIEL P,HELLMIG S,HAMPE J,et al.Influence of polymor-phisms in the NOD1/CARD4 and NOD2/CARD15 genes on the clinical outcome of Helicobacter pylori infection[J]. Cell Micro-biol,2006,8(7):1188-1198.

[9]席瓊,胡巢鳳.NOD樣受體在炎癥反應中的調(diào)控作用[J].中國動脈硬化雜志,2016,24(5):474-478.

[10]侯亮,路英進,陳偉,等.NOD1/RIP2信號通路對巨噬細胞炎性活化的作用[J].生命科學,2010,22(5):454-458.

[11]van LIMBERGEN J,RUSSELL R K,NIMMO E R,et al.Contribution of the NOD1/CARD4 insertion/deletion polymorphism +32656 to inflammatory bowel disease in Northern Europe[J]. Inflamm Bowel Dis,2007,13(7):882-889.

[12]唐寅思,曹蓉,翁洋,等.幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達變化[J].山東醫(yī)藥,2016,56(21):79-81.

[13]HARDER J,NUNEZ G.Functional expression of the intracellular pattern recognition receptor NOD1 in human keratinocytes[J]. J Invest Dermatol,2009,129(5):1299-1302.

[14]ANGELETTI S,GALLUZZO S,SANTINI D,et al.NOD2/CARD15 poly-morphisms impair innate immunity and increase susceptibility to gastric cancer in an Italian population[J].Hum Immunol,2009,70(9):729-732.

[15]VIALA J,CHAPUT C,BONECA I G,et al.Nod1 responds to peptido-glycan delivered by the helicobacter pylori cag pathogenicity is-land[J].Nat Immunol,2004,5(11):1166-1174.

[16]YANG X,LU H,YAN B,et al.ΔNp63 versatilely regulates a broad NF-kB gene program and promotes squamous epithelial proliferation,migration,and inflammation[J].Cancer Res,2011, 71(10):3688-3700.

[17]AFRIN M R,ARUMUGAM S,RAHMAN M A,et al.Le carbone,acharcoalsupplement,modulatesDSS-induced acute colitis in mice through activation of AMPKα and downregulation of STAT3 and caspase 3 dependent apoptotic pathways[J]. International Immunopharmacology,2016,12(43):70-78.

Expression and significance of nucleotide binding oligomerization domains 1 and 2 inHelicobacter pylori-associated gastric cancer

Xue-chun Wang1,Feng-qin Zhang2
(1.School of Stomatology,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050011,China; 2.Department of Pathology,Harrison International Peace Hospital Affiliated Hebei Medical University,Hengshui,Hebei 053000,China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of NOD1 and NOD2 in patients with Helicobacter pylori (Hp)associated gastric cancer.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of NOD1 and NOD2 proteins in patients withHp-associated gastric cancer.The expression of NOD1 and NOD2 mRNA was detected by real-time PCR.Western blot was used to detect the expression of NF-κB and Caspase-3.ResultsCompared with the control group (patients withHp-negative gastric cancer), the expression of NOD1 and NOD2 protein and mRNA in the patients withHp-positive gastric cancer increased significantly,the levels of NF-κB and Caspase-3 in theHp-positive gastric cancer patients were increased (P＜0.05).ConclusionsCompared with theHp-negative gastric cancer,NOD1 and NOD2 are highly expressed in the patients withHp-associated gastric cancer.And NOD1 and NOD2 over-expressions may play important roles in the development and progression ofHp-associated gastric cancer.

Helicobacter pylori;gastric cancer;NOD;apoptosis;immunohistochemistry

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.008

1005-8982（2017）18-0043-04

2017-03-30