劉冬松，劉安兵，陳岳明

（1.浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 金華 321017；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310006）

IL-2及IL-2Rα基因多態(tài)性與漢族兒童支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)

劉冬松1，劉安兵2，陳岳明2

（1.浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 金華 321017；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310006）

目的探討IL-2（rs6822844）及IL-2Rα（rs2104286）基因多態(tài)性和漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)。方法隨機(jī)選取144例支氣管哮喘患兒為病例組，228例健康兒童為對(duì)照組。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）直接測(cè)序鑒定各位點(diǎn)基因型；同時(shí)采用qRT-PCR檢測(cè)對(duì)照組IL-2Rα各基因型外周血IL-2Rα信使核糖核酸（mRNA）相對(duì)表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各基因型血漿sIL-2Rα水平。結(jié)果IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)等位基因A在病例組分布頻率（86.8%）高于對(duì)照組（79.4%）（=1.708，95%CI：1.113，2.629，P=0.010），病例組中AA基因型分布頻率（75.0%）高于對(duì)照組（62.3%）（=1.745，95%CI：1.058，2.884，P=0.021）；未發(fā)現(xiàn)IL-2（rs6822844）位點(diǎn)有多態(tài)性分布。對(duì)照組中IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)AA基因型個(gè)體外周血IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量以及血漿sIL-2Rα水平均高于AG基因型（Z=-2.029和-2.361，P =0.043和0.018）。結(jié)論IL-2Rα（rs2104286）基因多態(tài)性可能與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生相關(guān)，而且該位點(diǎn)基因型可影響其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。

支氣管哮喘；基因多態(tài)性；白細(xì)胞介素2；白細(xì)胞介素2a受體

支氣管哮喘是兒童常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病之一，是由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥并導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的喘息、呼吸困難、胸悶及咳嗽等癥狀。全球范圍內(nèi)哮喘發(fā)病越來(lái)越普遍，目前約有3.34億人患病[1]。2010年中國(guó)國(guó)家兒童哮喘協(xié)作組調(diào)查顯示兒童哮喘全國(guó)流行率約0.42%～5.73%，全國(guó)平均水平約2.32%[2-3]。輔助性T細(xì)胞1型（T helper 1 cell，Thl）和輔助性T細(xì)胞2型（T helper 2 cel，Th2）比值失衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制[4]。白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）是Thl型細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素2α受體（interleukin-2 receptor alpha，IL-2Rα）與IL-2結(jié)合在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能方面起關(guān)鍵作用。IL-2Rα脫落入血液后形成可溶性IL-2Rα（soluble interleukin-2 receptor alpha，sIL-2Rα）。研究顯示，支氣管哮喘患者肺泡灌洗液IL-2水平升高，中度持續(xù)性哮喘患者血清sIL-2Rα也高于輕度持續(xù)性哮喘患者[5-6]。細(xì)胞因子的合成受遺傳因素影響[7]，因此，哮喘除環(huán)境因素外，患者的遺傳背景同樣起重要作用。本研究以漢族支氣管哮喘兒童為病例組，以漢族健康兒童為對(duì)照組，分析兩組IL-2（rs6822844）及IL-2Rα（rs2104286）多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率、基因型分布差異，旨在鑒定上述位點(diǎn)與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2013年8月～2015年12月在金華市中醫(yī)醫(yī)院和杭州市第一人民醫(yī)院兒科門診及住院的漢族支氣管哮喘患兒。依據(jù)2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組修訂的兒童哮喘防治常規(guī)[8]確診為支氣管哮喘的急性發(fā)作期兒童144例為病例組。其中，男性79例，女性65例；年齡6個(gè)月～11歲，中位年齡3.7歲；病程2個(gè)月～7年，中位數(shù)2.4年。以杭州市第一人民醫(yī)院兒童保健門診228例漢族健康兒童為對(duì)照組。其中，男性123例，女性105例；年齡6個(gè)月～10歲，中位年齡3.2歲；無(wú)呼吸道及其他部位感染以及過(guò)敏反應(yīng)史；各組均除外有呼吸衰竭、心力衰竭及先天性心臟病等疾病者；病例組和對(duì)照組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究獲得金華市中醫(yī)醫(yī)院及杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本收集及基因組脫氧核糖核酸DNA提取

全部對(duì)象采集空腹乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈血2ml各2管。其中，1管用于基因組DNA提取，采用全血基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自北京天根生化科技有限公司），按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取的DNA樣本采用紫外分光光度計(jì)確定DNA的純度和濃度，置入-20℃冷凍備用。另一管置2000r/min離心5min后，取血漿1ml置入-20℃冰箱冷凍備用。

1.3 基因型鑒定

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）擴(kuò)增引物均經(jīng)在線軟件設(shè)計(jì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/），由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系包括：10×緩沖液（無(wú)Mg2+離子）5μl，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphos phate，dNTP）（10mmol/L）4μl，Mg2+（25mmol/L）3μl，正向引物（10 nmol/L）1μl，反向引物（10 nmol/L）1μl，模板DNA 5μl，Taq DNA聚合酶（5 u/μl）1μl，用去離子水補(bǔ)齊至50μl反應(yīng)體系（日本TaKaRa Bio株式會(huì)社）。引物序列及擴(kuò)增條件見表1。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司完成，測(cè)序引物為正向引物。

1.4 IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量

按基因型結(jié)果，隨機(jī)抽取對(duì)照組中AA基因型、AG基因型標(biāo)本各50例。用Trizol（美國(guó)英維捷基公司）提取全血總RNA，按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas公司）說(shuō)明書操作合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。SYBR GreenⅠqRT-PCR檢測(cè)IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量，擴(kuò)增引物分別為，正向引物：5'-GGTCCC AGGCAGAGAATCAT-3'；反向引物：5'-CACCTTGTGTGTCCACCTGTA-3'。以β-肌動(dòng)蛋白（beta-actin，β-actin）作為內(nèi)參照基因，正向引物：5'-CTACAATG AGCTGCGTGTGG-3'；反向引物：5'-AAGGAAGGCTG GAAGAGTGC-3'。由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR檢測(cè)試劑購(gòu)自日本TaKaRa Bio株式會(huì)社，反應(yīng)體系按說(shuō)明書進(jìn)行配制。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃變性3min后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括95℃變性10s，60℃退火和延伸34s。根據(jù)2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量[9]。

表1 候選基因PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.5 血漿sIL-2Rα水平檢測(cè)

上述對(duì)照組中AA基因型、AG基因型標(biāo)本相對(duì)應(yīng)的血漿sIL-2Rα檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（美國(guó)Creative Diagnostics公司）。該試劑檢測(cè)線性范圍31.25～2 000.00 pg/ml，檢測(cè)下限為16 pg/ml。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律吻合度檢驗(yàn)、病例與對(duì)照組基因型和等位基因頻率分布均用χ2檢驗(yàn)；關(guān)聯(lián)分析用95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）的比值比（odds ratio）表示。不同基因型個(gè)體組間IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量及血漿sIL-2Rα水平用Mann-Whitney檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 候選基因位點(diǎn)等位基因頻率及基因型分布

本研究未發(fā)現(xiàn)IL-2（rs6822844）位點(diǎn)有多態(tài)性分布，該位點(diǎn)等位基因均為G。IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（χ2=0.517，P＞0.050）基因型測(cè)序結(jié)果。IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)等位基因A在病例組分布頻率（86.8%）高于對(duì)照組（79.4%）95%CI=1.113，2.629，P=0.010）；病例組中AA基因型分布頻率（75.0%）高于對(duì)照組（62.3%）95%CI=1.058，2.884，P=0.021）。見圖1和表2。

2.2 IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量

AA基因型攜帶者相對(duì)表達(dá)量（1.263±0.625）高于AG基因型攜帶者（1.044±0.436）（Z=-2.029，P=0.043）。見圖2。

2.3 IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)不同基因型個(gè)體血漿sIL-2Rα水平

AA基因型個(gè)體血漿sIL-2Rα水平（157.86± 67.21）高于AG基因型（126.41±58.63）（Z=-2.361，P=0.018）。見圖3。

圖1 IL-2Rα（rs2104286）、IL-2（rs6822844）位點(diǎn)基因型測(cè)序圖

表2 候選基因位點(diǎn)等位基因頻率及基因型分布 例（%）

圖2 IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)不同基因型IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖3 IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)不同基因型個(gè)體血漿sIL-2Rα水平

3 討論

IL-2是誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化增殖的主要細(xì)胞因子之一，在哮喘患者中IL-2激活Th2細(xì)胞觸發(fā)和維持氣道炎癥，刺激免疫球蛋白E分泌和黏液過(guò)度產(chǎn)生。T細(xì)胞膜表面的IL-2Rα脫落于血液形成sIL-2Rα，其不但是IL-2介導(dǎo)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)拮抗蛋白，而且是一種類似封閉因子的免疫抑制物，能中和T細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的IL-2，起到免疫調(diào)控作用[10]。

研究顯示，IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）均和Thl/Th2失衡相關(guān)疾病有關(guān)，如IL-2（rs6822844）位點(diǎn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[11]、系統(tǒng)性硬化病[12]；IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)和1型糖尿病[13]及幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等[14]。然而，上述位點(diǎn)與支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)目前還少見報(bào)道，特別是在中國(guó)漢族兒童中。本研究結(jié)果顯示，IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)等位基因A相對(duì)于G是致病基因；AA基因型個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)高于AG基因型個(gè)體。在本研究的樣本量?jī)?nèi)未發(fā)現(xiàn)IL-2（rs6822844）位點(diǎn)在中國(guó)漢族兒童中有多態(tài)性分布。

IL-2Rα（rs2104286）位于該基因第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)。CHISTIAKOV等[15]報(bào)道，對(duì)照組內(nèi)AA基因型個(gè)體血清sIL-2Rα水平均高于其他基因型，而在毒性彌漫性甲狀腺腫病例組內(nèi)各基因型間未發(fā)現(xiàn)差異。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中AA基因型個(gè)體外周血IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量以及血漿sIL-2Rα水平均高于AG基因型，提示rs2104286可能是IL-2Rα基因的一個(gè)功能性位點(diǎn)。許多自身免疫性疾病中IL-2Rα（CD25）單抗在降低疾病活動(dòng)性方面已顯示出很好的療效，其效應(yīng)不僅直接作用于T細(xì)胞，而且作用于自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[16]。最近，針對(duì)細(xì)胞因子在哮喘患者炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的復(fù)雜作用，學(xué)者們同樣認(rèn)為IL-2Rα拮抗劑可能是一個(gè)治療哮喘有希望的藥物[17]。

綜上所述，IL-2Rα（rs2104286）可能與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生相關(guān)，而且該位點(diǎn)可影響基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。此外，研究結(jié)果還提示，IL-2Rα可能是治療哮喘的一個(gè)潛在、有效的靶點(diǎn)，其基因型同時(shí)在指導(dǎo)個(gè)體化用藥方面有臨床意義。

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Association ofIL-2andIL-2Rαpolymorphisms with bronchial asthma in Chinese Han children

Dong-song Liu1,An-bing Liu2,Yue-ming Chen2
(1.Department of Laboratory Medicine,Jinhua Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinhua,Zhejiang 321017,China;2.Department of Laboratory Medicine,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou,Zhejiang 310006,China)

ObjectiveTo investigate the relationship betweenIL-2 (rs6822844)andIL-2Rα(rs2104286) gene Polymorphisms and bronchial asthma in Chinese Han children.MethodsA gender and age-matched case control study was conducted.A total of 144 children with bronchial asthma were enrolled into the case group and 228 healthy children into the control group randomly.The genotypes were determined by direct sequencing forthe productsoffluorescentquantitative polymerase chain reaction (PCR).The relative expression ofIL-2Rα mRNA in the peripheral blood was analyzed by real-time fluorescent PCR.The expression levels of plasma sIL-2Rα were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for the different genotype carriers in the control group.ResultsThe allele A distribution frequency ofIL-2Rα (rs2104286)in the case group(86.8%)was significantly higher than that of the control group(79.4%)[O＾R=1.708 (95%CI:1.113,2.629),P=0.010].The AA genotype frequency distribution in the case group (75.0%) was higher than that of the control group (62.3%)[O＾R=1.745 (95%CI:1.058,2.884),P=0.021].Thepolymorphism distribution ofIL-2 (rs6822844)was not found in the study.Additionally,both relative expression ofIL-2Rα mRNA in the peripheral blood and the plasma sIL-2Rα level of the individuals with AA genotype were significantly higher than those with AG genotype in the control group(P=0.043 and 0.018, respectively).ConclusionsThe gene polymorphism ofIL-2Rα (rs2104286)may be associated with the occurrence of bronchial asthma in Chinese Han children,and may regulate gene transcription and expression.

bronchial asthma;gene polymorphism;interleukin-2;interleukin-2 receptor alpha

R562.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.007

1005-8982（2017）18-0038-05

2016-12-15

陳岳明，E-mail：hzsylab@163.com