劉冬松，劉安兵，陳岳明

（1.浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科，浙江 金華 321017；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310006）

IL-2及IL-2Rα基因多態(tài)性與漢族兒童支氣管哮喘的關聯

劉冬松1，劉安兵2，陳岳明2

（1.浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科，浙江 金華 321017；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310006）

目的探討IL-2（rs6822844）及IL-2Rα（rs2104286）基因多態(tài)性和漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生的關聯。方法隨機選取144例支氣管哮喘患兒為病例組，228例健康兒童為對照組。用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）直接測序鑒定各位點基因型；同時采用qRT-PCR檢測對照組IL-2Rα各基因型外周血IL-2Rα信使核糖核酸（mRNA）相對表達量，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測各基因型血漿sIL-2Rα水平。結果IL-2Rα（rs2104286）位點等位基因A在病例組分布頻率（86.8%）高于對照組（79.4%）（=1.708，95%CI：1.113，2.629，P=0.010），病例組中AA基因型分布頻率（75.0%）高于對照組（62.3%）（=1.745，95%CI：1.058，2.884，P=0.021）；未發(fā)現IL-2（rs6822844）位點有多態(tài)性分布。對照組中IL-2Rα（rs2104286）位點AA基因型個體外周血IL-2Rα mRNA相對表達量以及血漿sIL-2Rα水平均高于AG基因型（Z=-2.029和-2.361，P =0.043和0.018）。結論IL-2Rα（rs2104286）基因多態(tài)性可能與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生相關，而且該位點基因型可影響其轉錄及表達。

支氣管哮喘；基因多態(tài)性；白細胞介素2；白細胞介素2a受體

支氣管哮喘是兒童常見的變態(tài)反應性疾病之一，是由肥大細胞、嗜酸性粒細胞及T淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥并導致氣道高反應，出現反復發(fā)作的喘息、呼吸困難、胸悶及咳嗽等癥狀。全球范圍內哮喘發(fā)病越來越普遍，目前約有3.34億人患病[1]。2010年中國國家兒童哮喘協作組調查顯示兒童哮喘全國流行率約0.42%～5.73%，全國平均水平約2.32%[2-3]。輔助性T細胞1型（T helper 1 cell，Thl）和輔助性T細胞2型（T helper 2 cel，Th2）比值失衡是哮喘發(fā)病的一個重要機制[4]。白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）是Thl型細胞分泌的重要細胞因子。白細胞介素2α受體（interleukin-2 receptor alpha，IL-2Rα）與IL-2結合在調節(jié)免疫系統功能方面起關鍵作用。IL-2Rα脫落入血液后形成可溶性IL-2Rα（soluble interleukin-2 receptor alpha，sIL-2Rα）。研究顯示，支氣管哮喘患者肺泡灌洗液IL-2水平升高，中度持續(xù)性哮喘患者血清sIL-2Rα也高于輕度持續(xù)性哮喘患者[5-6]。細胞因子的合成受遺傳因素影響[7]，因此，哮喘除環(huán)境因素外，患者的遺傳背景同樣起重要作用。本研究以漢族支氣管哮喘兒童為病例組，以漢族健康兒童為對照組，分析兩組IL-2（rs6822844）及IL-2Rα（rs2104286）多態(tài)性位點等位基因頻率、基因型分布差異，旨在鑒定上述位點與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生的關聯。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2013年8月～2015年12月在金華市中醫(yī)醫(yī)院和杭州市第一人民醫(yī)院兒科門診及住院的漢族支氣管哮喘患兒。依據2008年中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組修訂的兒童哮喘防治常規(guī)[8]確診為支氣管哮喘的急性發(fā)作期兒童144例為病例組。其中，男性79例，女性65例；年齡6個月～11歲，中位年齡3.7歲；病程2個月～7年，中位數2.4年。以杭州市第一人民醫(yī)院兒童保健門診228例漢族健康兒童為對照組。其中，男性123例，女性105例；年齡6個月～10歲，中位年齡3.2歲；無呼吸道及其他部位感染以及過敏反應史；各組均除外有呼吸衰竭、心力衰竭及先天性心臟病等疾病者；病例組和對照組間性別、年齡差異無統計學意義。所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究獲得金華市中醫(yī)醫(yī)院及杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 標本收集及基因組脫氧核糖核酸DNA提取

全部對象采集空腹乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈血2ml各2管。其中，1管用于基因組DNA提取，采用全血基因組DNA提取試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司），按照說明書進行操作，提取的DNA樣本采用紫外分光光度計確定DNA的純度和濃度，置入-20℃冷凍備用。另一管置2000r/min離心5min后，取血漿1ml置入-20℃冰箱冷凍備用。

1.3 基因型鑒定

實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）擴增引物均經在線軟件設計（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/），由上海輝睿生物技術有限公司合成。PCR擴增體系包括：10×緩沖液（無Mg2+離子）5μl，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphos phate，dNTP）（10mmol/L）4μl，Mg2+（25mmol/L）3μl，正向引物（10 nmol/L）1μl，反向引物（10 nmol/L）1μl，模板DNA 5μl，Taq DNA聚合酶（5 u/μl）1μl，用去離子水補齊至50μl反應體系（日本TaKaRa Bio株式會社）。引物序列及擴增條件見表1。PCR產物由上海生工生物工程股份有限公司完成，測序引物為正向引物。

1.4 IL-2Rα mRNA相對表達量

按基因型結果，隨機抽取對照組中AA基因型、AG基因型標本各50例。用Trizol（美國英維捷基公司）提取全血總RNA，按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas公司）說明書操作合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。SYBR GreenⅠqRT-PCR檢測IL-2Rα mRNA相對表達量，擴增引物分別為，正向引物：5'-GGTCCC AGGCAGAGAATCAT-3'；反向引物：5'-CACCTTGTGTGTCCACCTGTA-3'。以β-肌動蛋白（beta-actin，β-actin）作為內參照基因，正向引物：5'-CTACAATG AGCTGCGTGTGG-3'；反向引物：5'-AAGGAAGGCTG GAAGAGTGC-3'。由上海輝睿生物技術有限公司合成。qRT-PCR檢測試劑購自日本TaKaRa Bio株式會社，反應體系按說明書進行配制。PCR反應循環(huán)參數為：95℃變性3min后進行40個循環(huán)，包括95℃變性10s，60℃退火和延伸34s。根據2-ΔΔCt法來計算IL-2Rα mRNA相對表達量[9]。

表1 候選基因PCR引物序列及擴增條件

1.5 血漿sIL-2Rα水平檢測

上述對照組中AA基因型、AG基因型標本相對應的血漿sIL-2Rα檢測采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（美國Creative Diagnostics公司）。該試劑檢測線性范圍31.25～2 000.00 pg/ml，檢測下限為16 pg/ml。實驗操作嚴格按說明書進行。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律吻合度檢驗、病例與對照組基因型和等位基因頻率分布均用χ2檢驗；關聯分析用95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）的比值比（odds ratio）表示。不同基因型個體組間IL-2Rα mRNA相對表達量及血漿sIL-2Rα水平用Mann-Whitney檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 候選基因位點等位基因頻率及基因型分布

本研究未發(fā)現IL-2（rs6822844）位點有多態(tài)性分布，該位點等位基因均為G。IL-2Rα（rs2104286）位點等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（χ2=0.517，P＞0.050）基因型測序結果。IL-2Rα（rs2104286）位點等位基因A在病例組分布頻率（86.8%）高于對照組（79.4%）95%CI=1.113，2.629，P=0.010）；病例組中AA基因型分布頻率（75.0%）高于對照組（62.3%）95%CI=1.058，2.884，P=0.021）。見圖1和表2。

2.2 IL-2Rα mRNA相對表達量

AA基因型攜帶者相對表達量（1.263±0.625）高于AG基因型攜帶者（1.044±0.436）（Z=-2.029，P=0.043）。見圖2。

2.3 IL-2Rα（rs2104286）位點不同基因型個體血漿sIL-2Rα水平

AA基因型個體血漿sIL-2Rα水平（157.86± 67.21）高于AG基因型（126.41±58.63）（Z=-2.361，P=0.018）。見圖3。

圖1 IL-2Rα（rs2104286）、IL-2（rs6822844）位點基因型測序圖

表2 候選基因位點等位基因頻率及基因型分布 例（%）

圖2 IL-2Rα（rs2104286）位點不同基因型IL-2Rα mRNA相對表達量

圖3 IL-2Rα（rs2104286）位點不同基因型個體血漿sIL-2Rα水平

3 討論

IL-2是誘導Th1細胞分化增殖的主要細胞因子之一，在哮喘患者中IL-2激活Th2細胞觸發(fā)和維持氣道炎癥，刺激免疫球蛋白E分泌和黏液過度產生。T細胞膜表面的IL-2Rα脫落于血液形成sIL-2Rα，其不但是IL-2介導免疫應答的調節(jié)拮抗蛋白，而且是一種類似封閉因子的免疫抑制物，能中和T細胞產生過多的IL-2，起到免疫調控作用[10]。

研究顯示，IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）均和Thl/Th2失衡相關疾病有關，如IL-2（rs6822844）位點與類風濕關節(jié)炎[11]、系統性硬化病[12]；IL-2Rα（rs2104286）位點和1型糖尿病[13]及幼年特發(fā)性關節(jié)炎等[14]。然而，上述位點與支氣管哮喘發(fā)生的關聯目前還少見報道，特別是在中國漢族兒童中。本研究結果顯示，IL-2Rα（rs2104286）位點等位基因A相對于G是致病基因；AA基因型個體患病風險高于AG基因型個體。在本研究的樣本量內未發(fā)現IL-2（rs6822844）位點在中國漢族兒童中有多態(tài)性分布。

IL-2Rα（rs2104286）位于該基因第一個內含子內。CHISTIAKOV等[15]報道，對照組內AA基因型個體血清sIL-2Rα水平均高于其他基因型，而在毒性彌漫性甲狀腺腫病例組內各基因型間未發(fā)現差異。本研究同樣發(fā)現，對照組中AA基因型個體外周血IL-2Rα mRNA相對表達量以及血漿sIL-2Rα水平均高于AG基因型，提示rs2104286可能是IL-2Rα基因的一個功能性位點。許多自身免疫性疾病中IL-2Rα（CD25）單抗在降低疾病活動性方面已顯示出很好的療效，其效應不僅直接作用于T細胞，而且作用于自然殺傷細胞和樹突狀細胞[16]。最近，針對細胞因子在哮喘患者炎癥級聯反應中的復雜作用，學者們同樣認為IL-2Rα拮抗劑可能是一個治療哮喘有希望的藥物[17]。

綜上所述，IL-2Rα（rs2104286）可能與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生相關，而且該位點可影響基因轉錄及表達。此外，研究結果還提示，IL-2Rα可能是治療哮喘的一個潛在、有效的靶點，其基因型同時在指導個體化用藥方面有臨床意義。

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Association ofIL-2andIL-2Rαpolymorphisms with bronchial asthma in Chinese Han children

Dong-song Liu1,An-bing Liu2,Yue-ming Chen2
(1.Department of Laboratory Medicine,Jinhua Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinhua,Zhejiang 321017,China;2.Department of Laboratory Medicine,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou,Zhejiang 310006,China)

ObjectiveTo investigate the relationship betweenIL-2 (rs6822844)andIL-2Rα(rs2104286) gene Polymorphisms and bronchial asthma in Chinese Han children.MethodsA gender and age-matched case control study was conducted.A total of 144 children with bronchial asthma were enrolled into the case group and 228 healthy children into the control group randomly.The genotypes were determined by direct sequencing forthe productsoffluorescentquantitative polymerase chain reaction (PCR).The relative expression ofIL-2Rα mRNA in the peripheral blood was analyzed by real-time fluorescent PCR.The expression levels of plasma sIL-2Rα were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for the different genotype carriers in the control group.ResultsThe allele A distribution frequency ofIL-2Rα (rs2104286)in the case group(86.8%)was significantly higher than that of the control group(79.4%)[O＾R=1.708 (95%CI:1.113,2.629),P=0.010].The AA genotype frequency distribution in the case group (75.0%) was higher than that of the control group (62.3%)[O＾R=1.745 (95%CI:1.058,2.884),P=0.021].Thepolymorphism distribution ofIL-2 (rs6822844)was not found in the study.Additionally,both relative expression ofIL-2Rα mRNA in the peripheral blood and the plasma sIL-2Rα level of the individuals with AA genotype were significantly higher than those with AG genotype in the control group(P=0.043 and 0.018, respectively).ConclusionsThe gene polymorphism ofIL-2Rα (rs2104286)may be associated with the occurrence of bronchial asthma in Chinese Han children,and may regulate gene transcription and expression.

bronchial asthma;gene polymorphism;interleukin-2;interleukin-2 receptor alpha

R562.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.007

1005-8982（2017）18-0038-05

2016-12-15

陳岳明，E-mail：hzsylab@163.com