樊曉靜，史志濤，孫昕

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬自治區(qū)中醫(yī)院 普外一科三組，新疆 烏魯木齊 830000）

結(jié)腸癌患者ΔNp63和NF-κB的表達(dá)及意義

樊曉靜，史志濤，孫昕

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬自治區(qū)中醫(yī)院 普外一科三組，新疆 烏魯木齊 830000）

目的探討結(jié)腸癌患者N末端截短型p63基因（ΔNp63）和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的表達(dá)及意義。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸癌患者ΔNp63和NF-κB的表達(dá)；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blot檢測(cè)ΔNp63和NF-κB信使核糖核酸（mRNA）和蛋白的表達(dá)；采用半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，結(jié)腸癌患者ΔNp63蛋白表達(dá)升高35.57%，NF-κB蛋白表達(dá)升高58.93%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)腸癌患者ΔNp63和NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)腸癌患者Caspase-3活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論結(jié)腸癌患者ΔNp63和NF-κB呈過(guò)度表達(dá)狀態(tài)；ΔNp63和NF-κB的過(guò)表達(dá)在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中可能起到重要作用。

結(jié)腸癌；N末端截短型p63基因；核轉(zhuǎn)錄因子κB；免疫組織化學(xué)

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病最為廣泛的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。結(jié)腸癌的發(fā)病由環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣及遺傳等多因素共同作用[3]，但結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制迄今尚不明確。研究表明，原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[1-3]。N末端截短型p63基因（N distal end brachytmema p63 gene，ΔNp63）是抑癌基因p53家族成員之一，參與細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡的調(diào)控[4-5]；核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）是一類具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[6-7]。ΔNp63和NF-κB的調(diào)解作用可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，本研究主要探討ΔNp63和NF-κB在結(jié)腸癌組織中的分布，以及ΔNp63和NF-κB蛋白表達(dá)變化和作用意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本材料 選取2014年9月-2016年7月本院腫瘤外科收集的85原發(fā)性結(jié)腸癌標(biāo)本，均經(jīng)組織病理學(xué)確診。其中，男性49例，女性36例；平均發(fā)病年齡52歲（24～76歲）；低分化腺癌23例，高中分化腺癌62例；侵及黏膜和淺肌層15例，至深肌層和全層70例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例。同時(shí)，取35例手術(shù)末端未見(jiàn)腫瘤浸潤(rùn)的正常結(jié)腸組織標(biāo)本作為對(duì)照。研究符合倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 一抗ΔNp63、NF-κB及肌動(dòng)蛋白（β-actin，ACTB）單克隆抗體（購(gòu)于美國(guó)Abcam公司），二抗堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、DAB染色盒、抗體稀釋液及中性樹(shù)脂（購(gòu)于北京中杉金橋有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（購(gòu)自日本TaKaRa公司），Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ΔNp63和NF-κB的蛋白表達(dá)水平 取患者的結(jié)腸癌病理石蠟標(biāo)本及正常結(jié)腸組織標(biāo)本共120例，分別進(jìn)行連續(xù)切片6張（8 μm/張）。用5%血清進(jìn)行室溫封閉40min后，分別加入1∶1 000的ΔNp63或NF-κB單克隆抗體4℃過(guò)夜孵育。隔天加入1∶1 000的二抗37℃孵育30min，PBS清洗后加入SP后進(jìn)行恒溫反應(yīng)30min，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，中性樹(shù)膠封片后用（×10、×40）顯微鏡進(jìn)行觀察。陽(yáng)性染色：ΔNp63和NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。（×40）顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，采用IPP軟件進(jìn)行圖像掃描分析，收集數(shù)據(jù)并計(jì)算圖片中ΔNp63和NF-κB蛋白表達(dá)的平均光密度（mean optical density，MOD）。MOD=累積光密度（integrated optical density，IOD）與面積（area）的比值，用于反應(yīng)組織中ΔNp63和NF-κB蛋白的表達(dá)含量。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)標(biāo)本中ΔNp63和NF-κB mRNA表達(dá)含量 Trizol法提取結(jié)腸癌組織中的總RNA，用TaKaRa公司的Prime Script RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR操作。每個(gè)樣本設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，每個(gè)目的基因重復(fù)3次。最終得到Ct值（threshold cycles）和溶解曲線的參數(shù)，實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)定量法，根據(jù)公式計(jì)算出待測(cè)樣品中目的基因（β-actin）和管家基因的準(zhǔn)確含量，以樣本的目的基因與管家基因之間含量比值，即循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）值比較法作為評(píng)價(jià)目的基因表達(dá)量的指標(biāo)進(jìn)行分析，計(jì)算不同樣本間的相對(duì)百分比。公式：ΔΔCt=（Ct實(shí)驗(yàn)組的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組管家基因）-（Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組管家基因）。目的mRNA的量=2-ΔΔCt。

1.2.3 Western blot檢測(cè)ΔNp63和NF-kB的蛋白表達(dá)水平 收集結(jié)腸癌組織，加入裂解液冰上裂解2h。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30μg/μl。將各組蛋白樣品加入到10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后按1∶1 000的稀釋比例加入一抗和二抗。用ECL顯色劑顯色，并對(duì)各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算蛋白的表達(dá)量。

1.2.4 凋亡蛋白活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3取組織裂解離心并收集蛋白上清液，稀釋后加入反應(yīng)緩沖液（reaction buffer含10 mol/LDTT）及5μl 4 mol/L LEHD-pNA底物，37℃孵育1h。酶標(biāo)儀405nm測(cè)定其吸光度A值。Caspase-3活性單位（u）=（各組A值-凋零組A值）/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，每次重復(fù)3孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ΔNp63和NF-κB免疫組織化學(xué)結(jié)果

正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中的ΔNp63蛋白免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)腸癌組織中ΔNp63呈高表達(dá)水平。正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中的NF-κB蛋白免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)腸癌組織中NF-κB呈高表達(dá)水平。見(jiàn)圖1、2。

圖1 ΔNp63的蛋白表達(dá)

圖2 NF-κB的蛋白表達(dá)

2.2 ΔNp63和NF-kB的蛋白表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)結(jié)果分析顯示，結(jié)腸癌組織中ΔNp63蛋白表達(dá)比正常結(jié)腸組織中的蛋白表達(dá)增加（P=0.000），ΔNp63的蛋白表達(dá)量增加35.57%；結(jié)腸癌組織中NF-κB蛋白表達(dá)比正常結(jié)腸組織中的蛋白表達(dá)增加（P=0.000），NF-κB的蛋白表達(dá)量增加58.93%。見(jiàn)附表。

2.3 ΔNp63和NF-κB mRNA表達(dá)情況

與正常結(jié)腸組織ΔNp63 mRNA表達(dá)（1.00± 0.00）比較，結(jié)腸癌組織中ΔNp63 mRNA表達(dá)升高（1.37±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=43.740，P=0.000），NF-κB mRNA表達(dá)升高（1.84±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=80.950，P=0.000），說(shuō)明結(jié)腸癌組織中ΔNp63和NF-κB mRNA水平高度表達(dá)。

2.4 ΔNp63和NF-κB蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果分析顯示，與正常結(jié)腸組織ΔNp63蛋白表達(dá)（0.55±0.03）比較，結(jié)腸癌組織中ΔNp63蛋白表達(dá)升高（0.74±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.060，P=0.000）。與正常結(jié)腸組織NF-κB蛋白表達(dá)（1.27±0.12）比較，NF-κB蛋白表達(dá)升高（1.89± 0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.620，P=0.000），說(shuō)明結(jié)腸癌組織中ΔNp63和NF-κB蛋白水平呈高度表達(dá)。見(jiàn)圖3。

附表 ΔNp63和NF-κB的蛋白表達(dá)變化 （±s）

附表 ΔNp63和NF-κB的蛋白表達(dá)變化 （±s）

組別NF-κB蛋白表達(dá)正常結(jié)腸組織 0.684±0.039 0.857±0.024結(jié)腸癌組織 0.941±0.029 1.362±0.037 t值 23.650 51.210 P值 0.000 0.000ΔNp63蛋白表達(dá)

2.5 Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果

與正常結(jié)腸組織Caspase-3活性（0.64±0.04）u比較，結(jié)腸癌組織中的Caspase-3活性（0.75±0.08）u提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.559，P=0.000）。

圖3 ΔNp63和NF-κB蛋白表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌是人類健康與生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]，研究表明，原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[3]。ΔNp63（特異性標(biāo)記凋亡的缺乏酸性N端反式激活區(qū)的截短型p6）是抑癌基因p53家族成員之一，是p63在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的主要表達(dá)形式[4-8]。ΔNp63通過(guò)阻斷TAp63和p53介導(dǎo)的反式激活，競(jìng)爭(zhēng)性與DNA結(jié)合，在抑制細(xì)胞周期和調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中起到重要作用[9-10]。NF-κB作為一種多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，在炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞增殖等生理病理過(guò)程中發(fā)揮作用[11-12]，激活后可密切參與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞凋亡的過(guò)程[13-14]，最終導(dǎo)致效應(yīng)性Caspase-3活化，胞核內(nèi)DNA鏈斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體，細(xì)胞死亡發(fā)生[15]。

本研究結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸標(biāo)本組織比較，結(jié)腸癌組織中ΔNp63和NF-κB的蛋白表達(dá)含量均上升；同時(shí)Western blot結(jié)果也顯示結(jié)腸癌組織中ΔNp63和NF-kB的蛋白表達(dá)含量上調(diào)。結(jié)腸癌組織中ΔNp63和NF-κB mRNA表達(dá)含量均與比正常結(jié)腸組織mRNA表達(dá)升高。結(jié)果表明在基因與蛋白水平上ΔNp63和NF-kB均呈過(guò)度表達(dá)狀態(tài)，參與結(jié)腸癌的發(fā)展。且由于ΔNp63和NF-κB表達(dá)含量的異常性升高，不僅調(diào)控結(jié)腸癌的細(xì)胞的增殖過(guò)程，更加速細(xì)胞凋亡的過(guò)程，促使凋亡基因Caspase-3活性升高。結(jié)果說(shuō)明ΔNp63和NF-κB的特異性表達(dá)加速細(xì)胞凋亡的過(guò)程，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡發(fā)生。

綜上所述，ΔNp63和NF-κB在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定的抑癌作用，加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但ΔNp63和NF-κB如何調(diào)控相關(guān)抑癌基因及加速細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。在正常人群中，結(jié)腸上皮細(xì)胞中的ΔNp63的異常表達(dá)可能提示結(jié)腸癌的發(fā)生，聯(lián)合檢測(cè)NF-kB的蛋白表達(dá)含量有助于結(jié)腸癌的診斷與確診，為臨床治療提供有效的幫助。

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Expression of ΔNp63 and NF-κB in colon cancer patients and significance

Xiao-jing Fan,Zhi-tao Shi,Xin Sun
(Department of General Surgery,Xinjiang Uyghur Autonomous Region Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830000,China)

ObjectiveTo investigate the expression and effect of ΔNp63 and NF-κB in patients with colon cancer.MethodsThe expressions of ΔNp63 and NF-κB in patients with colon cancer were detected by immunohistochemical method.The mRNA and protein expressed by ΔNp63 and NF-κB were detected by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)and Western blot.The expression of Caspase-3 in apoptotic cells was detected by Caspase-3 activity assay kit.ResultsCompared with the control group,the level of protein expressed by ΔNp63 rose by 35.57%and the level of protein expressed by NF-κB rose by 58.93%, the difference was statistically significant(P＜0.05).The mRNA and protein expressed by ΔNp63 and NF-κB were obviously up-regulated,the differences were statistically significant (P＜0.05).The activity of Caspase-3 in the colon cancer group was obviously increased,the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionsThe expressions of ΔNp63 and NF-κB in colon cancer patients are over-expressed,and the over-expressed ΔNp63 and NF-κB may play important roles in the development and progression of colon cancer.

colon cancer;Np63;NF-κB;immunohistochemistry

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.005

1005-8982（2017）18-0028-04

2017-01-05