黃智述，任黔川

（1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 瀘州 646000）

臨床研究·論著

miR-29a在宮頸癌組織中的表達及其上調后對宮頸癌細胞惡性生物學行為的影響

黃智述1，任黔川2

（1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 瀘州 646000）

目的檢測微小RNA（miR）-29a在宮頸癌組織和不同種類宮頸癌細胞系中的表達情況及其上調后對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等惡性生物學行為的影響。方法①組織標本檢測：收集2014年7月-2016年7月西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院活檢或手術切除的宮頸組織標本160例，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-29a的表達情況，并分析宮頸癌組織中miR-29a的表達與臨床病理特征的關系。②細胞學實驗：采用qRT-PCR檢測miR-29a在不同種類的人宮頸癌細胞系（SiHa、HeLa、Caski及C33a）和人正常宮頸細胞系Ect1/E6E7中的表達水平，選取miR-29a表達最低的宮頸癌細胞系SiHa進行后續(xù)研究，使用miR-29a mimics轉染SiHa細胞，qRT-PCR檢測轉染后細胞miR-29a的表達變化，CCK-8法檢測轉染后細胞增殖活力的變化，流式細胞儀檢測轉染后細胞凋亡率的變化，Transwell實驗檢測轉染后細胞遷移和侵襲能力的變化。結果宮頸鱗癌組織中miR-29a表達低于HSIL、LSIL及正常宮頸組織（P＜0.05）；HSIL組織中miR-29a表達低于LSIL及正常宮頸組織（P＜0.05），LSIL與正常宮頸組織間miR-29a的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。宮頸鱗癌組織中miR-29a的表達與患者臨床分期和淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。miR-29a在人宮頸癌細胞系（SiHa、HeLa、Caski和C33a）中的表達低于人正常宮頸細胞系Ect1/E6E7（P＜0.05）。SiHa細胞轉染miR-29a mimics后，miR-29a表達水平增高（P＜0.05），細胞增殖活力降低（P＜0.05），細胞凋亡率增高（P＜0.05），細胞遷移和侵襲能力下降（P＜0.05）。結論miR-29a在宮頸癌組織和細胞中均呈低表達，上調miR-29a的表達能夠抑制宮頸癌SiHa細胞的增殖及侵襲遷移能力，促進細胞的凋亡。

miR-29a；子宮頸癌；SiHa細胞

宮頸癌是女性常見婦科惡性腫瘤之一，在世界范圍內，宮頸癌的發(fā)病率和病死率已居于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1]，并且近年來呈年輕化趨勢[2]。根治性手術和放化療是目前宮頸癌的主要治療方式，但由治療產(chǎn)生的不良反應嚴重影響患者的生命質量。因此，從分子水平探討宮頸癌的發(fā)生機制，尋找臨床治療宮頸癌有效的基因靶點迫在眉睫。microRNA是一組內源性、長度在18～25個核苷酸非編碼蛋白質的單鏈RNA，其可以通過與靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)結合調節(jié)靶基因的表達，參與機體炎癥反應、免疫應答、細胞增殖及凋亡等生理病理過程[3-4]。目前研究顯示，微小RNA-29a（miR-29a）在多種人類惡性腫瘤組織中起著促癌基因或者抑癌基因的作用[5-7]，但至今為止，miR-29a在宮頸癌方面的研究國內外甚少。本研究檢測miR-29a在宮頸癌組織和宮頸癌細胞系中的表達并分析上調miR-29a表達對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等惡性生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 選取2014年7月-2016年7月在西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診活檢或手術切除的宮頸組織標本共160例。其中，宮頸鱗癌標本80例，宮頸高級別鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）標本40例，宮頸低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）標本20例，正常宮頸組織標本20例。標本取出后立即放入液氮中，置入-80℃冰箱冷凍保存。所有患者活檢或術前均未行放化療等治療，全部病理切片經(jīng)過西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科專家復閱確診。宮頸癌患者臨床分期采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的分期標準，Ⅰ期35例，Ⅱ期45例；病理分級：G119例，G239例，G322例；有淋巴結轉移23例，無淋巴結轉移者57例。本研究所有患者均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞系 人宮頸癌細胞系（SiHa、HeLa、Caski和C33a）和人正常宮頸細胞株Ect1/E6E7（購自中國科學院上海細胞庫），用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃含5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱中。

1.1.3 主要試劑 miR-29a mimics及陰性對照mimics-NC（均購自上海吉瑪制藥技術公司），Trizol試劑和LipofectamineTM2000（購自美國Invitrogen公司），RNA逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（購自日本TaKaRa公司），miR-29a及內參U6引物由廣州銳博生物公司設計合成，Cell counting Kit-WST-8（CCK-8）試劑盒（購自上海東仁公司），Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒（購自南京凱基生物公司），Transwell小室（購自美國Corning公司），基質膠（購自美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 將對數(shù)生長期的SiHa細胞接種于6孔板中，常規(guī)條件培養(yǎng)，融合度達到50%～60%時進行細胞轉染，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染操作，實驗組每孔加入100 pmol miR-29a mimics及5μl轉染試劑，對照組每孔加入100pmol mimics-NC及5μl轉染試劑，轉染后qRTPCR檢測 miR-29a的表達，確定轉染效果再進行體外細胞實驗。

1.2.2 qRT-PCR法檢測組織和細胞中miR-29a的表達 Trizol法提取組織或細胞總RNA，超微量分光光度計測RNA濃度，嚴格按試劑盒說明書逆轉錄反應合成cDNA，反應條件：37℃水溶60min，95℃干溶5min。取逆轉錄產(chǎn)物為模板，利用定量PCR試劑盒、miR-29a及內參U6特異性引物進行qRT-PCR檢測，反應條件：95℃預變性15min，94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，擴增45個循環(huán)。以U6作為內參基因，2-△△Ct法計算miR-29a相對表達量，實驗重復3次。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖 活力細胞接種于96孔板，常規(guī)條件培養(yǎng)，融合度達到50%～60%時進行細胞轉染，分別于轉染后24、48、72及96 h取出培養(yǎng)箱，參照CCK-8試劑盒操作說明書操作向每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃避光孵育1h后用酶標儀測定波長450 nm處的各孔對應的吸光度值，每組設5個復孔。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 上述轉染細胞于48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后離心收集細胞，PBS洗滌細胞，離心棄上清液，調整細胞濃度為（1～5）×105個/ml，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，室溫避光孵育15min后進行流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡百分比，實驗重復3次。

1.2.5 Transwell體外遷移和侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力 上述細胞轉染后24 h，胰蛋白酶消化收集細胞，用無血清培液對各組細胞進行饑餓處理，Transwell小室膜水化預處理后，向上室每孔加入含2×105個細胞的細胞懸液，下層加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽小心擦去上室表面未遷移的細胞，固定、染色，顯微鏡下觀察、拍照，隨機選取顯微鏡下選5個視野，計數(shù)穿出細胞數(shù)，取平均數(shù)，實驗重復3次。侵襲實驗時，將Transwell小室進行包被基質膜處理，用基質膠包被Transwell小室基底膜，待基質膠凝固后進行后續(xù)實驗，之后的實驗步驟同遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，計數(shù)資料以率（%）表示并行χ2檢驗，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸鱗癌、HSIL、LSIL及正常宮頸組織中miR-29a的相對表達量

經(jīng)qRT-PCR檢測宮頸鱗癌、HSIL、LSIL及正常宮頸組織中miR-29a的表達水平，組間整體比較差異有統(tǒng)計學意義（F=1394.78，P=0.000）；進一步多重比較結果顯示，LSIL及正常宮頸組織中miR-29a的表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），宮頸鱗癌和HSIL組織中miR-29a表達低于LSIL及正常宮頸組織（P＜0.05），且宮頸癌組織中miR-29a表達低于HSIL組織（P＜0.05）。見圖1。

2.2 miR-29a表達與宮頸鱗癌臨床病理特征的相關性分析

以宮頸鱗癌組織miR-29a均值水平為臨界值，分為miR-29a高表達和miR-29a低表達，與患者年齡、腫瘤直徑、病理分級、間質浸潤深度、臨床分期及有無淋巴轉移等臨床病理特征的相關性進行統(tǒng)計學分析，結果表明，宮頸鱗癌組織中miR-29a的低表達與臨床分期和淋巴結轉移相關（P＜0.05），提示低表達的miR-29a可能參與腫瘤的發(fā)展及轉移過程。見附表。

2.3 各細胞系miR-29a的相對表達量

圖1 宮頸組織中miR-29a的相對表達

附表 不同臨床病理特征與宮頸鱗癌miR-29a低表達率關系

經(jīng)qRT-PCR檢測，miR-29a在正常宮頸細胞系Ect1/E6E7和宮頸癌細胞系（SiHa、HeLa、Caski及C33a）組間整體差異有統(tǒng)計學意義（F=155.33，P=0.000）；進一步多重比較結果顯示，宮頸癌細胞系（SiHa、HeLa、 Caski及C33a）中miR-29a的表達水平較正常宮頸細胞系Ect1/E6E7均降低（P＜0.05）（見圖2）。其中，SiHa細胞系相對表達最低，因此選擇SiHa細胞系作為后續(xù)實驗的研究對象，SiHa細胞轉染miR-29a mimics，經(jīng)qRT-PCR證實，miR-29a在miR-29a mimics組、mimics-NC組和空白對照組3組間整體差異有統(tǒng)計學意義（F=1798.47，P=0.000）；進一步多重比較結果顯示，miR-29a mimics組中miR-29a的表達水平高于mimics-NC組和空白對照組（P＜0.05），提示轉染miR-29a mimics可上調SiHa細胞miR-29a的表達水平（P＜0.05），證明轉染效率較高。見圖3。

2.4 上調miR-29a的表達抑制SiHa細胞的增殖

將miR-29a mimics組和mimics-NC組SiHa細胞于轉染后24、48、72及96 h時進行CCK-8增殖實驗，采用重復測量設計的方差分析，結果顯示：①轉染后不同時間的細胞增殖比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.489，P=0.000）；②miR-29a mimics組和mim ics-NC組細胞增殖情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.559，P=0.000）；③miR-29a mimics組和mimics-NC組細胞增殖的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.148，P=0.000）。見圖4。

圖2 miR-29a在正常宮頸細胞系與宮頸癌細胞系中的相對表達

圖3 各組SiHa細胞中miR-29a的相對表達

圖4 轉染miR-29a mimics對SiHa細胞增殖活力的影響

2.5 上調miR-29a的表達促進SiHa細胞的凋亡

流式細胞術結果顯示，miR-29a mimics組SiHa細胞的凋亡率高于mimics-NC組細胞（t=11.364，P=0.000），提示上調miR-29a的表達能夠促進SiHa細胞的凋亡。見圖5。

2.6 上調miR-29a的表達抑制SiHa細胞的遷移及侵襲能力

Transwell遷移實驗檢測上調miR-29a后SiHa細胞遷移能力的變化，miR-29a mimics組和mimics-NC組細胞穿入下層小室的細胞數(shù)目分別為：（112±10）和（202±18）個/HP，miR-29a mimics組穿膜細胞數(shù)少于mimics-NC組（t=7.570，P=0.002），表明上調miR-29a的表達能夠抑制SiHa細胞的遷移能力。Transwell侵襲實驗檢測上調miR-29a后SiHa細胞侵襲能力的變化，結果表明，miR-29a mimics組和mimics-NC組細胞穿入下層小室的細胞數(shù)目分別為（86±8）和（184±16）個/HP，miR-29a mimics組穿膜細胞數(shù)少于mimics-NC組（t=9.489，P=0.001），表明上調miR-29a的表達能夠抑制SiHa細胞的侵襲能力。見圖6。

圖5 轉染miR-29a mimics對SiHa細胞凋亡率的影響

圖6 轉染miR-29a mimics對SiHa細胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

在人類復雜的基因調控網(wǎng)絡中miRNA起著極其重要的作用，miRNA在轉錄后水平調節(jié)基因的表達，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲和遷移，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。miR-29a是miR-29家族成員之一，其定位于人染色體7q32.3的負鏈，其在人類的腦及心臟組織中高表達，在機體免疫反應、腫瘤形成等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[10]。miR-29家族主要包括miR-29a、miR-29b及miR-29c 3個成員。目前，miR-29a與腫瘤關系的研究較少，并且作用機制尚不完全明確。近期逐漸增多的研究表明miR-29a在惡性腫瘤組織中表達減低，提示miR-29a的低表達可能參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。MUNIYAPPA等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-29a在侵襲性肺癌細胞中表達降低，上調miR-29a的表達可以抑制其侵襲能力。XU等[12]通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-29a在多種實體惡性腫瘤中表達降低。WU等[5]在研究中證實miR-29a在乳腺癌組織及細胞中表達水平下降，miR-29a可以靶向調控B-Myb基因抑制腫瘤細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同的宮頸病變組織中表達水平有差異，隨著子宮頸病變由正常宮頸和LSIL逐步向HSIL和宮頸癌演變的過程中，miR-29a的表達水平逐步減低，miR-29a在正常宮頸和LSIL組織中表達水平相對較高，而在宮頸鱗癌及HSIL組織中呈低表達，且miR-29a在宮頸鱗癌組織中的表達低于HSIL，隨后筆者進一步對正常宮頸細胞系和宮頸癌細胞系檢測發(fā)現(xiàn)miR-29a在宮頸癌細胞系中的表達低于正常宮頸細胞系，因此推測miR-29a的表達缺失可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。目前研究已證實，在兒童急性髓細胞白血病中，miR-29a的表達水平越低，臨床分期越晚，預后越差[13]。在大腸癌中，低水平的miR-29a提示癌癥的分級高，預后差[14]。本研究進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中miR-29a的表達與患者的臨床分期和淋巴結轉移相關，低水平的miR-29a提示患者較晚的分期及淋巴結轉移的可能。

腫瘤患者90%死于轉移[15]，腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移等惡性生物學行為是腫瘤進展、影響患者生存期的重要原因。本研究細胞學試驗證實上調miR-29a的表達能抑制腫瘤細胞的增殖活力，增高腫瘤細胞的凋亡率，并且降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，提示miR-29a在宮頸癌中屬于抑癌基因，有望成為臨床治療宮頸癌的基因靶點。有關miR-29a調控腫瘤細胞惡性生物學行為的具體分子生物學機制尚不明確。目前研究表明，miR-29a能夠抑制NF-KB信號通路[16]，直接抑制DNA甲基轉移酶活性[17]，誘導腫瘤細胞凋亡。GEBESHUBER等[18]在研究中還發(fā)現(xiàn)，miR-29a能夠通過抑制鋅脂蛋白36的表達抑制腫瘤的EMT過程。目前，miR29a在宮頸癌中調控其惡性生物學行為的具體機制還缺乏充分的解釋，尚需要在更進一步的研究闡明。

綜述所述，miR-29a在宮頸癌中的表達水平降低，可作為宮頸癌進展的有效分子指標，上調miR-29a的表達能夠抑制宮頸癌細胞的增殖及侵襲遷移能力，促進細胞的凋亡，為宮頸癌的發(fā)病機制及臨床診療提供新的思路。

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Expression of miR-29a in cervical cancer and effect of miR-29a up-regulation on malignant biologic behaviors of cervical cancer cells

Zhi-shu Huang1,Qian-chuan Ren2
(1.Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Department of Gynaecology and Obstetrics,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-29a in specimens and cells of cervical cancer and explore the effect of up-regulafion of miR-29a expression on proliferation,apoptosis,invasion and migration of cervical cancer cells further.MethodsTotally 160 cases of biopsy or surgical specimens were collected in the Affiliated Hospital of Southwest Medical University from July 2014 to July 2016,including 80 cases of cervical cancer,40 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL),20 cases of low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL)and 20 cases of normal cenix.The expression levels of miR-29a indifferent cervical tissues were examined by qRT-PCR.The correlations of miR-29a expression with the clinicopathological parameters of patients were analyzed.The expressions of miR-29a in four cervical cancer cell lines (SiHa,HeLa,Caski,C33a)and one normal cervical cell line Ect1/E6E7 were also examined by qRT-PCR.SiHa cells with the lowest expression of miR-29a were selected in the follow-up studies.SiHa cells were transfected with miR-29a mimics,and the expression of miR-29a in transfected cells was detected by qRT-PCR.CCK-8 assay,flowcytometry and Transwell assay were used to analyze the effect of miR-29a mimics on the proliferation,apoptosis,invasion and migration of SiHa cells.ResultsThe expression of miR-29a in cervical squamous cancer was lower than that in HSIL,LSIL and normal cervical tissue(P＜0.05),and the expression of miR-29a in HSIL was lower than that in LSIL and normal cervical tissue(P＜0.05),while there was no significant difference between LSIL and normal cervical tissues (P＞0.05).The expression level of miR-29a in cervical squamous cancer was correlated with clinical stage and lymph node metastasis (P＜0.05).The expression of miR-29a in cervical cancer cell lines was lower than that in normal cervical cell line(P＜0.05).After transfection with miR-29a mimics,the expression of miR-29a was significantly increased (P＜0.05),the proliferation activity was significantly decreased (P＜0.05),the apoptosis rate was significantly increased(P＜0.05),and the cell migration and invasion abilities in SiHa cells were significantly decreased(P＜0.05).ConclusionsThe expression of miR-29a significantly decreases in cervical cancer tissues and cells. Up-regulation of miR-29a can inhibit proliferation,migration and invasion,and promote apoptosis in SiHa cells.

miR-29a;cervical cancer;SiHa cell

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.004

1005-8982（2017）18-0022-06

2017-01-25

任黔川，E-mail：tyl_wf@yeah.net