王纓，胡貴榮，李弼民

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，江西 南昌 330006）

IgA腎病大鼠腎組織中T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因1的表達(dá)和意義*

王纓，胡貴榮，李弼民

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，江西 南昌 330006）

目的 觀察IgA腎?。↖gAN）大鼠腎組織中T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因1（TIM-1）的表達(dá)，探討TIM-1在IgAN大鼠發(fā)病中的作用。方法 20只雄性SD大鼠隨機(jī)分成IgAN模型組和對(duì)照組，每組10只。在復(fù)制模型完成后處死大鼠，取腎臟，腎組織切片行PAS染色，免疫熒光觀察大鼠腎臟病理變化，并行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織中TIM-1的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)TIM-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 IgAN組TIM-1主要分布在腎小球和腎小管，表達(dá)量較對(duì)照組增加（P＜0.05）。IgAN組腎組織中TIM-1 mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組升高。TIM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和腎臟病理Katafuchi評(píng)分呈正相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 TIM-1可能參與了IgAN的發(fā)生發(fā)展。

腎小球腎炎；IgA；T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因-1

IgA腎病（IgA Nephropathy，IgAN）是目前最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病之一，目前國(guó)際上尚無(wú)廣泛被認(rèn)同的IgAN發(fā)病機(jī)制，其中機(jī)體免疫功能障礙，多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)分泌異常被認(rèn)為是IgAN發(fā)病的重要因素。T細(xì)胞亞群分化異常在多種自身免疫疾病發(fā)病中漸被闡明證實(shí)，Th1/Th2失衡與IgAN相關(guān)性也已開(kāi)始受到重視。T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain，TIM）基因家族共同編碼具有多種生物活性的I型跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)并參與多種T細(xì)胞介導(dǎo)的各類免疫反應(yīng)。其中，T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因1（TIM-1）與其天然配體T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因4（TIM-4）特異性結(jié)合共刺激T細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡[1]。綜上所述，Th1/Th2失衡參與IgAN發(fā)病，而TIM-1信號(hào)通路可調(diào)控多種T細(xì)胞亞群免疫功能，調(diào)節(jié)T細(xì)胞平衡，那么在腎臟組織中TIM-1的表達(dá)如何？本研究通過(guò)復(fù)制IgAN大鼠模型，觀察IgAN大鼠腎組織中TIM-1的表達(dá)，初步探討TIM-1在IgAN中的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

20只SPF級(jí)SD大鼠，均為雄性，體重180～200 g。購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件。

1.2 動(dòng)物模型的復(fù)制及分組

20只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（n= 10）和模型組（n=10）。模型組：牛血清白蛋白（美國(guó)Sigma公司）按400 mg/kg隔日灌胃，至復(fù)制模型結(jié)束共9周；在第6周和第8周末通過(guò)尾靜脈注射脂多糖（美國(guó)Sigma公司），0.05 mg/（只·次）；每個(gè)周末通過(guò)皮下注射四氯化碳CCl4（美國(guó)Sigma公司），每只每次蓖麻油0.5 ml+CCl40.1 ml，共9周；在相同時(shí)間給予正常對(duì)照組等體積蒸餾水灌胃，同體積生理鹽水皮下注射及同等量的生理鹽水尾靜脈注射。

1.3 取材及標(biāo)本處理

實(shí)驗(yàn)第9周復(fù)制模型完成后，采用3%戊巴比妥麻醉大鼠迅速游離腎臟，放入10%中性甲醛固定后用石蠟進(jìn)行包埋，留待行光鏡檢查及免疫組織化學(xué)檢查，另一部分放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織TIM-1的表達(dá)

采用SP法檢測(cè)TIM-1（英國(guó)Abcam公司），陽(yáng)性組織呈棕色，半定量結(jié)果分析采用 Image pro-plus 6.0圖像采集軟件，每張切片隨機(jī)采集20個(gè)視野（10×物鏡），用Image pro-plus 6.0圖像分析軟件對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行分析，其陽(yáng)性染色面積/視野總面積即為免疫組織化學(xué)陽(yáng)性目標(biāo)的強(qiáng)度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)大鼠腎臟組織中TIM-1 mRNA表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA，參照cDNA試劑盒（AE301-02，北京全式金生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)合成cDNA。采用大連寶生物有限公司PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃5 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃ 15 s（退火溫度及循環(huán)周期依據(jù)引物和PCR產(chǎn)物而定）。所有引物序列均由Invitrogen公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，IgAN模型組和正常對(duì)照組比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)IgAN模型組的TIM-1表達(dá)與臨床、病理資料進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05時(shí)差異為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理結(jié)果

光鏡組織學(xué)見(jiàn)正常對(duì)照組腎小球系膜細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞增多，基質(zhì)無(wú)明顯增生，毛細(xì)血管襻開(kāi)放，腎小管未見(jiàn)明顯異常，腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯增生，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組在腎小球內(nèi)可見(jiàn)明顯的系膜細(xì)胞增多，系膜基質(zhì)中到重度增生，毛細(xì)血管管腔狹窄，腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)腫脹變性的腎小管上皮細(xì)胞。免疫熒光：正常對(duì)照組未見(jiàn)IgA沉積，模型組可見(jiàn)團(tuán)塊狀或顆粒狀綠色I(xiàn)gA熒光。見(jiàn)圖1。

2.2 兩組大鼠臨床指標(biāo)比較

IgAN模型組大鼠24 h尿蛋白定量高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IgAN模型組大鼠血清白蛋白較正常對(duì)照組則下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組血肌酐相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 兩組大鼠腎臟病理學(xué)改變

表2 兩組大鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白及腎功能的比較 （±s）

表2 兩組大鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白及腎功能的比較 （±s）

注：?與正常對(duì)照組同時(shí)期相比，P＜0.05

項(xiàng)目血肌酐/（μmol/L）正常對(duì)照組 39.254±8.433 IgAN模型組 42.32±8.670血清白蛋白/（g/L）4.321±0.498 36.217±0.783 8.744±1.942? 20.940±1.779?t值24 h尿蛋白定量/g-6.721 7.734 P值 0.003 0.004 0.951 -0.073

2.3 兩組大鼠腎臟病理?yè)p傷Katafuchi評(píng)分

每張HE染色切片取任意5個(gè)高倍鏡（×40）視野，每個(gè)視野取任意2個(gè)小球和2個(gè)小管，IgAN模型組和正常對(duì)照組的Katafuchi評(píng)分分別為（6.303± 1.949）和（1.301±0.823），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 9.682，P=0.000），IgAN模型組高于正常對(duì)照組。

2.4 兩組大鼠腎臟TIM-1的表達(dá)

正常對(duì)照組僅在腎小管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)少量TIM-1陽(yáng)性表達(dá)，而IgAN模型組陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組增多，廣泛分布在腎小球細(xì)胞核和腎小管上皮細(xì)胞核，見(jiàn)圖2；IgAN模型組和正常對(duì)照組的TIM-1定量積分分別為（7.519±1.580）和（1.036±0.824），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-11.551，P=0.000），IgAN模型組高于正常對(duì)照組。

2.5 兩組大鼠腎臟TIM-1 mRNA的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，IgAN模型組和正常對(duì)照組的 TIM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（2.033±0.784）和（0.830±0.209），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.532，P=0.001），IgAN模型組高于正常對(duì)照組。

2.6 TIM-1表達(dá)與各個(gè)臨床及病理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

采用雙變量Pearson相關(guān)性分析法，可見(jiàn)IgAN模型組大鼠腎臟 TIM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與TIM-1半定量積分呈正相關(guān)（r=0.481）（見(jiàn)圖3），分別分析IgAN模型組大鼠腎臟TIM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)和24 h尿白蛋白定量、血清白蛋白變化、腎臟病理?yè)p傷Katafuchi評(píng)分及TIM-1半定量積分的相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表3、圖3。在IgAN模型組中，TIM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與24 h尿白蛋白的變化呈正相關(guān)，與血清白蛋白變化呈負(fù)相關(guān)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TIM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和腎臟病理Katafuchi評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.846），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 兩組大鼠腎臟TIM-1的表達(dá)

表3 TIM-1 mRNA與24 h尿白蛋白、血清白蛋白及腎臟病理?yè)p傷Katafuchi評(píng)分相關(guān)性分析

圖3 TIM-1 mRNA與24 h尿白蛋白、血清白蛋白及腎臟病理?yè)p傷Katafuchi評(píng)分相關(guān)性

3 討論

目前國(guó)際上尚無(wú)廣泛被認(rèn)同的IgAN發(fā)病機(jī)制，其中機(jī)體免疫功能障礙，多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)分泌異常被認(rèn)為是IgAN發(fā)病重要因素。T細(xì)胞亞群分化異常在多種自身免疫疾病發(fā)病中漸被闡明證實(shí)，Th1/Th2失衡與IgAN相關(guān)性也已開(kāi)始受到重視。早在上世紀(jì)90年代年ANDRE等[2]已經(jīng)檢測(cè)到大部分IgAN患者腎小球系膜區(qū)均有IgAl分子高表達(dá)，而過(guò)量IgA1需要由成熟B細(xì)胞在Th2細(xì)胞或病毒抗原的刺激下才能生成。人們還發(fā)現(xiàn)自發(fā)性產(chǎn)生IgAN的ddY小鼠幼鼠為T(mén)hl優(yōu)勢(shì),但成年小鼠卻呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢(shì)、血清IgA水平升高，NOGAKI等[3]由此提出Thl/Th2失衡與IgA的分泌水平相關(guān)，Th2優(yōu)勢(shì)時(shí)分泌過(guò)量IL-4、IL-6等細(xì)胞因子，IL-4和IL-6不僅正反饋Th2過(guò)度分化，還同時(shí)刺激B細(xì)胞活化、增殖，并增加抗體分泌，可能在促進(jìn)IgAN的發(fā)病中占據(jù)重要地位。肖俊等[4]發(fā)現(xiàn)IgAN較正常人外周血中IFN-γ表達(dá)減少,而IL-4比例升高,Th1/Th2比值下降并與血IgA水平構(gòu)成正比，證實(shí)了IgAN患者外周血中Th1/Th2失衡向Th2偏倚。近年來(lái)，參與自身免疫性疾病的發(fā)病的Treg/Th17細(xì)胞平衡在IgAN患者向Treg有所偏倚也漸受重視，LIN等[5]證實(shí)了其腎臟組織Foxp3表達(dá)上調(diào)、而致炎因子IL-17A的表達(dá)減少，盡管在血清中IL-17A表達(dá)有所升高。

21世紀(jì)初MCINTIRE等[6]在分析人類染色體5q23-35基因與哮喘的易感性時(shí)，在染色體5q33.2上識(shí)別出一個(gè)基因的主要序列編碼完全背離了控制氣道高反應(yīng)性的TAPR調(diào)節(jié)器，且與人類甲肝病毒（HAV）受體同源，首次將其命名為T(mén)IM-1。TIM家族在小鼠有8個(gè)基因（TIM-1至TIM-8），其中TIM-5至TIM-8為有待證實(shí)序列的預(yù)測(cè)基因，在人類發(fā)現(xiàn)有 3個(gè)：TIM-1（Havcrl）、TIM-3（Havcr2）、TIM-4[7]。小鼠和人類 TIM基因編碼區(qū)分別位于染色體11b1.1和5q33.2上，這兩處染色體區(qū)在人類基因圖譜中被證實(shí)為與過(guò)敏性和自身免疫性疾病易感性相關(guān)，中國(guó)地區(qū)的兒童哮喘等的發(fā)病有可能也同TIM-1、TIM-3、TIM-4的基因多態(tài)性存在一定聯(lián)系[8]。T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白基因家族編碼的跨膜糖蛋白具有多種生物活性，各自表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、APC等不同細(xì)胞表面，主要參與調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的各種免疫反應(yīng)，其中，TIM-1與其天然配體TIM-4特異性結(jié)合，共刺激T細(xì)胞增殖，可調(diào)節(jié)多種效應(yīng)性T細(xì)胞的表達(dá)，影響Th1/Th2細(xì)胞的平衡[9]，而Th1/Th2失衡，Th0分化向Th2偏倚，在調(diào)節(jié)Th2反映中起重要作用。研究證實(shí)在Henoch-Schonlein purpura患者外周血單核細(xì)胞中Th2占優(yōu)勢(shì)且TIM-1mRNA的表達(dá)上調(diào)，并與血清IgA1和IL-4分子水平呈正相關(guān)[9]。在有關(guān)哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)TIM-1介導(dǎo)免疫反應(yīng)，當(dāng)給予抗TIM-1抗體后可減少氣道黏液高分泌，且IL-4表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明TIM-1通過(guò)調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞，參與了氣道高反應(yīng)[10]。

1998年，ICHIMURA等[11]又將其命名為腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1），因在缺血再灌注大鼠模型中確定該分子的高度表達(dá)與腎小管損傷程度相關(guān)。KIM-1是人們發(fā)現(xiàn)的首個(gè)非骨髓源性清道夫受體，由腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，并參與腎小管中凋亡細(xì)胞的吞噬清除和誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。KIM-1在近膜端釋放出細(xì)胞外區(qū)并溶于尿液，由于在健康腎臟中幾乎不表達(dá)，尿液KIM-1聯(lián)合中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）、IL-8、半胱氨酸酶抑制劑Cysc等的檢測(cè)等可以作為急性腎缺血性損傷、慢性腎臟病等各類腎損傷的診斷及預(yù)后標(biāo)志。NOZAKI等[12]發(fā)現(xiàn)TIM-1增強(qiáng)新月體性腎小球腎炎T細(xì)胞免疫應(yīng)答，并促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的腎臟損害。在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用TIM-1抗體后腎臟NF-κB的表達(dá)及促炎因子、趨化因子的表達(dá)下降，而且腎臟的免疫炎癥反應(yīng)也受到抑制[13]。人們?cè)贗gAN發(fā)病中對(duì)TIM-1的研究還比較少，本研究中觀察到IgAN大鼠腎臟TIM-1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，與腎臟病理組織學(xué)損傷程度呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)觀察到IgAN大鼠腎臟TIM-1 mRNA的表達(dá)上調(diào)與24 h尿白蛋白定量呈正相關(guān)，與血清白蛋白呈負(fù)相關(guān)，但可能因?yàn)闃颖玖窟^(guò)小或檢驗(yàn)方法的局限性，相關(guān)性分析結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)TIM-1可能一定程度參與大鼠IgAN的發(fā)病及進(jìn)展。

Th1/Th2和Treg/Th17失衡均參與IgAN發(fā)病，而TIM-1信號(hào)通路可調(diào)控多種T細(xì)胞亞群免疫功能，調(diào)節(jié)T細(xì)胞平衡，究竟TIM-1在IgAN的免疫發(fā)病機(jī)制中如何發(fā)揮作用，是否通過(guò)調(diào)控Th1/Th2、 Treg/Th17參與IgAN發(fā)??？這將是下一步的研究方向。

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（張西倩 編輯）

E xpression of TIM-1 in renal tissue of IgAN rats and significance*

Ying Wang,Gui-rong Hu,Bi-min Li
(Department of Nephrology,the Frist Affliated Hospital of Nanchang University, Nanchang,Jiangxi 330006,China)

Objective To investigate the expression of T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-1(TIM-1)in rats with IgA nephropathy(IgAN),and to explore the role of TIM-1 in the pathogenesis of IgAN.Methods Twenty male SD rats were randomized into two groups,i.e.IgAN model group(10 rats)and control group(10 rats). The rats were sacrificed after the completion of building the model and the kidneys were obtained.The pathological changes of the rat kidneys were observed after PAS and immunofluorescence staining.Immunohistochemical staining was used to detect the expression of TIM-1 protein and RT-PCR was used to measure the expression of TIM-1 mRNA in the renal tissue.Results TIM-1 expression in the IgAN group mainly distributed in glomeruli and renal tubules,the expression levels of TIM-1 mRNA and protein significantly increased in the IgAN group compared with those in the control group(P＜0.05).A positive correlation was found between the expression quantity of TIM-1 mRNA and Katafuchi score(r=0.846,P＜0.05).Conclusions TIM-1 may be involved in the occurrence and development of IgAN.

IgAN;T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-1(TIM-1);rat

R-332

A

2016-12-20

江西省自然科學(xué)基金（No：20142BAB205006）；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No：14005）

李弼民，E-mail：lbmjx@163.com ·12·

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.003

1005-8982（2017）19-0012-05