張磊，馬海春，蘇酩，劉善新，王杰，靳光乾*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000；4.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

參貝消癭顆粒的HPLC特征圖譜

張磊1,2，馬海春3，蘇酩2，劉善新2，王杰4，靳光乾2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000；4.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021)

建立了參貝消癭顆粒的HPLC特征圖譜。采用ODS-2 Hypersil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1% 磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm，進(jìn)樣量5 μL。建立的特征圖譜具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，9批樣品特征圖譜的相似度均大于0.95，確定了5個(gè)共有特征峰，并指認(rèn)出其中2個(gè)為芍藥苷、迷迭香酸，同時(shí)通過(guò)對(duì)單味藥材的特征圖譜的對(duì)比分析確定各特征峰的來(lái)源。該方法準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，可用于參貝消癭顆粒的質(zhì)量控制。

參貝消癭顆粒；HPLC；特征圖譜

橋本甲狀腺炎(HT)是典型的器官特異性自身免疫性疾病[1]，屬于中醫(yī)的“癭病”范疇[2-3]。其發(fā)病年齡主要集中在40～60歲，女性發(fā)病率高且近年來(lái)有明顯上升趨勢(shì)[4-5]。近年來(lái)中醫(yī)藥在本病的治療和研究領(lǐng)域均取得了較好的成果[6]，但臨床使用的中成藥較少見(jiàn)。參貝消癭顆粒的組方是山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，由白芍、夏枯草、烏藥、黃芪等15味中藥組成，具有理氣舒郁、化痰清熱、散結(jié)消癭的功能，用于治療橋本甲狀腺炎氣郁痰阻、壅結(jié)化熱證，在臨床中取得了較好的療效。中藥復(fù)方是依靠其所含的多種化學(xué)成分發(fā)揮綜合的醫(yī)療作用，而中藥特征圖譜具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點(diǎn)，能較全面地反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相對(duì)比例，更加全面地展示中成藥質(zhì)量[7-8]。為制訂參貝消癭顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文對(duì)參貝消癭顆粒進(jìn)行了HPLC特征圖譜研究。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀，Ultimate 3000紫外檢測(cè)器，Chromeleon7工作站(美國(guó)Thermo)；BP211D 電子天平(德國(guó)Sartorius)； LC-350A超聲波中藥處理器(濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠，功率250 W，頻率40 kHz)。

1.2 藥品和試劑

芍藥苷(批號(hào)110736-201438，純度：96.4%)、迷迭香酸(批號(hào)111871-201404，純度：98.6%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；參貝消癭顆粒由本課題組提供；藥材購(gòu)自山東百味堂中藥飲片有限公司、山東上藥集團(tuán)有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院靳光乾主任藥師鑒定，均為《中國(guó)藥典》2015版一部[9]各藥材項(xiàng)下收載的正品；乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher Scientific)；超純水(美國(guó)MiLLipore)；其余試劑均為分析純。

2 特征圖譜的測(cè)定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ODS-2 Hypersil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm，美國(guó)Thermo)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～60 min，2% ～ 30% A)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取參貝消癭顆粒研細(xì)，取3 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷后稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷、迷迭香酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷120 μg、迷迭香酸10.4 μg的混合溶液，即得。

2.2.3 各藥材溶液的制備

取處方中藥材各10 g，參照參貝消癭顆粒樣品的制備工藝及2.2.1項(xiàng)下方法分別制成藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品(批號(hào)20151204)溶液5 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，以芍藥苷為參照物，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.2%(n=5)，相對(duì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%(n=5)。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品(批號(hào)20151204)5份，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定5次，以芍藥苷為參照物，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.1%(n=5)，相對(duì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%(n=5)。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品(批號(hào)20151204)溶液5 μL，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以芍藥苷為參照物，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%(n=5)，相對(duì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%(n=5)。

2.4 特征圖譜的建立

取9批參貝消癭顆粒研細(xì)，各取3 g，精密稱定，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。將混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，確定對(duì)照品的位置。采用中國(guó)藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)應(yīng)用中位數(shù)法，對(duì)9批樣品進(jìn)行多點(diǎn)校正，時(shí)間窗為0.10，自動(dòng)匹配，即得參貝消癭顆粒HPLC特征圖譜共有模式，見(jiàn)圖1～3，以芍藥苷為參照計(jì)算9批樣品圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.95，見(jiàn)表1。經(jīng)分析對(duì)比，確定5個(gè)共有峰作為其特征峰，以1號(hào)峰(芍藥苷對(duì)照品相應(yīng)的峰)為S峰，計(jì)算其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2～3。

圖1 9批樣品特征圖譜Fig.1 Specific chromatograms of 9 batches of samples

1芍藥苷；2迷迭香酸。圖2 對(duì)照品HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

1芍藥苷；4迷迭香酸。圖3 特征圖譜共有模式Fig.3 Common mode of specific chromatograms

表1 9批樣品相似度結(jié)果(n=9)

表2 9批樣品相對(duì)保留時(shí)間(n=9)

表3 9批樣品相對(duì)峰面積(n=9)

2.5 特征峰歸屬

通過(guò)與圖2對(duì)照，確定圖3中的1號(hào)峰為芍藥苷，4號(hào)峰為迷迭香酸。通過(guò)與單味藥材特征圖譜比較，發(fā)現(xiàn)1、2號(hào)峰來(lái)源于白芍，3號(hào)峰來(lái)源于烏藥，4號(hào)峰來(lái)源于夏枯草，5號(hào)峰來(lái)源于黃芪，見(jiàn)圖4。

S1白芍；S2黃芪；S3烏藥；S4夏枯草；S5對(duì)照?qǐng)D譜。圖4 參貝消癭顆粒與單味藥材特征圖譜比較Fig.4 Comparison of specific chromatograms between Shenbei Xiaoying granules and single medicinal herb

3 討論

實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)提取溶劑進(jìn)行選擇，分別用90%甲醇、95%甲醇、甲醇、無(wú)水乙醇作為提取溶劑，結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇提取液峰較少，90%甲醇、95%甲醇提取液和甲醇提取液無(wú)明顯差別，因此選擇甲醇作為提取溶劑。對(duì)提取方法進(jìn)行比較，分別用超聲和加熱回流方法進(jìn)行提取，結(jié)果兩種提取方法所測(cè)結(jié)果基本一致，因此選擇超聲作為提取方法。對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，分別選取210、220、225、230、240、260、280、330 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在225 nm波長(zhǎng)下基線平穩(wěn)且各色譜峰響應(yīng)適中，故選擇225 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行考察，水相分別用純水、0.1%冰乙酸溶液和0.1%磷酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，基線平穩(wěn)且峰形較好，因此選擇0.1%磷酸溶液作為水相流動(dòng)相。

本研究建立了參貝消癭顆粒的特征圖譜，9批樣品的相似度大于0.95，確定了5個(gè)共有特征峰，其相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.8%(n=9)，說(shuō)明特征圖譜的色譜行為基本相同，而相對(duì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，是由于生產(chǎn)制劑使用的藥材有差異所致。同一種藥材，產(chǎn)地、批次、采收期、儲(chǔ)存時(shí)間不同均可導(dǎo)致藥材成分含量的差異。通過(guò)與對(duì)照品比較，指認(rèn)出1號(hào)峰為芍藥苷，4號(hào)峰為迷迭香酸，并通過(guò)與處方中藥材的特征圖譜單獨(dú)比較，指認(rèn)出5個(gè)共有峰中1、2號(hào)峰來(lái)源于白芍，3號(hào)峰來(lái)源于烏藥，4號(hào)峰來(lái)源于夏枯草，5號(hào)峰來(lái)源于黃芪。本研究所建立的特征圖譜靈敏度高、專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠較為全面地反映參貝消癭顆粒的內(nèi)在質(zhì)量并為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

[1]張明霞，李效忠，杲海霞，等.甲寧治療橋本甲狀腺炎機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥，2009，31(2)：290-292.

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[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying Granules

ZHANG Lei1,2，MA Hai-chun3，SU Ming2， LIU Shan-xin2，WANG Jie4, JIN Guang-qian2*

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China； 2.Shandong Academy of Chinese Medicine，Jinan 250014，China；3. Heze Food and Drug Inspection and Resarch Institute, Heze 274000，China；4. Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021，China)

∶The HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying Granules was established. Specific chromatogram was carried out on a ODS-2 Hypersil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), with gradient elution consisting of acetonitrile as mobile phase A and 0.1% phosphoric acid solution as mobile phase B. Column temperature was 30 ℃, flow rate was 1.0 mL·min-1，detection wavelength was 225 nm, and sample volume was 5 μL. The established HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying granules has good precision, repeatability and stability. The similarity of characteristic maps of 9 batches of Shenbei Xiaoying Granules was all greater than 0.95. Five common specific chromatogram peaks were determined, and two peaks were identified as paeoniflorin and rosemary acid．At the same time, the source of each characteristic peak in HPLC specific chromatogram was determined by comparing and analyzing the HPLC specific chromatogram of single medicinal herb. This method is accurate, reliable and specific, which can be used for the quality control of Shenbei Xiaoying Granules.

∶Shenbei Xiaoying Granules；HPLC；specific chromatograms

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.001

2016-11-10

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GGH218026)；濟(jì)南市科技計(jì)劃(201219008)；濟(jì)南市高校院所計(jì)劃(201401255)

張磊(1992—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬图靶录夹g(shù)。

*通信作者，靳光乾(1962—)，主任藥師。Tel：0531-82949812,E-mail：jgqjn1962@sina.com

R284.1

A

1002-4026(2017)04-0001-05